Aplicação de PCR em tempo real para a rastreabilidade e preservação de sementes de soja não transgênica

Orientadora : profª. Drª. Vanete Thomaz SoccolDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa: Curitiba, 25/02/2013Inclui referências : f. 88-103Área de concentração: Saúde humana e animalResumo: A presença crescente de culturas e produtos alimentares derivados de plantas geneticamente modificadas tem levado ao desenvolvimento de métodos de detecção capazes de distinguir entre alimentos derivados da biotecnologia e alimentos convencionais. A técnica de PCR convencional têm sido utilizada para detectar organismos geneticamente modificados (OGM) em matéria prima e em alimentos altamente processados. Porém, esta técnica não fornece informação quantitativa do OGM presente no alimento. O sucesso da medologia está relacionada a fatores como amostragem, o grau de processamento das amostras e a eficiência do método de extração de DNA. Existindo no Brasil, o Decreto n? 4.680/2003, que regulamenta a rotulagem obrigatória de alimentos que contenham acima de 1% de OGM em sua composição, torna-se necessário o uso de um método quantitativo para o controle dos limites exigidos. O presente trabalho teve como objetivos avaliar o método CTAB na extração de DNA de sementes e grãos de soja contaminados com quantidades diferentes de sementes de soja RR®, detectar por PCR e quantificar por PCR em tempo real o teor de transgenia em sementes e grãos de soja contaminados com diferentes quantidades de soja transgênica; avaliar a técnica de PCR em tempo real usando dois kits. Os resultados mostraram que o método CTAB foi eficiente na extração DNA das amostras. Os genes endógeno da soja e o RR® apresentaram bandas esperadas pela amplificação por PCR convencional. A PCR em tempo real detectou duas sementes GM em 500g de sementes de soja convencional e apenas uma semente GM em 100g de grãos de soja convencional. A metodologia utilizando os dois fluoróforos mostrou-se confiável na deteção de soja RR®, com nível de sensibildade similar, uma vez que os resultados obtidos de Ct revelaram valores próximos. Porém, apesar de ser menos específico que o kit Mericon Assay, o sistema SYBR Green foi capaz de detectar presença de OGM ao mesmo nível de sensibilidade do kit Mericon Assay, demostrando ser de eleição na rotina de laboratório e para trabalhos de prestação de serviços. Este método irá possibilitar a deteção de sementes transgênicas em lotes de semente convencional, permitirá aos produtores selecionar e preservar variedades de soja não transgênica. A técnica também possibilitará a detecção e quantificação de soja geneticamente modificada aprovada no Brasil e facultará as autoridades competentes ferramentas para o rastreio, identificação e controle de outros organismos geneticamente modificados que possam estar presentes em produtos alimentares comercializados no mercado Brasileiro, de modo a assegurar o cumprimento da lei existente. Palavras-chave: Soja Roundup Ready®, OGM, PCR, PCR em tempo real.Abstract: The increase presence of crops and food products derived from genetically modified organisms (GMO) has led to the development of detection methods that distinguish between foods derived from biotechnology and conventional foods. The conventional PCR technique has been used to detect GMO in raw material and highly processed foods. However, this technique does not provide quantitative information of genetically modified organisms present in the food. The success of the methodology is related to factors such as sampling, the degree of sample processing and efficiency of DNA extraction method. Existing in Brazil Decree n? 4.680/2003, wich regulates the mandatory labeling of food containing more than 1% of GMO in its composition, it becomes necessary to use a quantitative method to control que required limits. The present study aimed to evaluate the CTAB method for DNA extraction from seeds and soybeans contaminated with different amounts of RR® soybean seeds, detect by PCR and quantification by real-time PCR of transgenic in soybean seeds and grains contaminated with varying amounts of GM soy; evaluate the technique of real-time PCR using two fluorophores. The results showed that CTAB method was efficient in DNA extraction of samples.The endogenous gene and RR® exhibited expected bands by conventional PCR amplification. The real-time PCR detected two GM seeds in 500g of conventional soybean seeds and only one GM seed in 100g of conventional soybean grains. The methodology using two fluorophores proved to be reliable in the detection of RR® soybean, with similar sensibility level, since the results obtained Ct values showed close. However, despite being less specific than Mericon Assay kit, SYBR Green system was able to detect the presence of GMO at the same level of sensitivity Mericon Assay kit, demonstrating to be of election in routine laboratory work and service. This method will enable the detection of genetically modified seeds in conventional seed lots and allow producers to select and preserv non.GM soybean varieties. The technique will also enable the detection and quantification of GM soybean approved in Brazil and provide the authorities with tools of screening, identification and control of other GMO that may be present in food products sold in the Brazilian market, to ensure the compliance with existing law. Key-words: Roundup Ready® soybean, GMO, PCR, Real Time PCR