Respostas celulares à corantes reativos por métodos in vitro

Orientadora : Profª. Drª. Dorly de Freitas BuchiDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 20/03/2015Inclui referências : fls. 66-72Resumo: A pele, o maior órgão do corpo humano, principal interface entre o organismo e o meio ambiente, está constantemente exposta a fatores físicos, químicos e biológicos. Essas interações podem ocorrer de forma exacerbada e prejudicial, resultando em reações adversas, como processos inflamatórios cutâneos. Dentre o grupo de substâncias que podem apresentar riscos à saúde humana via exposição dérmica, têm-se os corantes têxteis. Inúmeros corantes têm sido empregados no tingimento de tecidos, entretanto, estudos têm mostrado que diversos grupos de corantes comumente utilizados são capazes de induzir efeitos deletérios aos organismos expostos, por exemplo, danos no DNA e reações alérgicas. O fato dos vestuários poderem conter substâncias químicas nocivas e o conhecimento de que, mesmo após sucessivas lavagens, os corantes são capazes de migrarem e penetrarem na pele em casos de transpiração intensa, a necessidade de uma melhor avaliação da segurança destes produtos tem se mostrado relevante e de caráter imediato. Métodos alternativos à experimentação animal (métodos in vitro) são atualmente utilizados para avaliar o potencial nocivo de diferentes produtos, tanto pelo setor acadêmico como industrial. O objetivo desse trabalho foi avaliar as respostas celulares relacionados a um possível processo inflamatório de dois corantes têxteis [Reactive Red 120 (RR120) - grupo azo e Reactive Blue 19 (RB19) - grupo antraquinona] comumente empregados no tingimento de fibras de algodão. A fim de mimetizar a via de exposição dérmica foram utilizadas duas linhagens celulares murinas, fibroblastos (BALB 3T3) e macrófagos (RAW 264.7). Para tanto, após a definição da faixa de concentração tóxica de cada corante teste por ensaios de citotoxicidade (MTT e NRU), foram avaliadas a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em conjunto com a detecção e quantificação de citocinas inflamatórias. A condição geral das células da pele foi determinada pela avaliação da morfologia celular através de técnicas de microscopia de luz e eletrônica de varredura. Para a análise estatística foi utilizada a análise de variância ANOVA seguido do teste de Tukey. As culturas celulares expostas a estes corantes por 24 horas mostraram, tanto através da microscopia de luz quanto na eletrônica de varredura, que os corantes em estudo possuem ação citotóxica nas concentrações acima de 500 ?g/ml. As duas linhagens celulares aumentaram a liberação de ROS, com maior destaque para o corante RB19. A ação inflamatória dos corantes RR120 e RB19 foi então detectada nos fibroblastos pelo aumento na liberação das proteínas Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1) e IL-6, caracterizando uma resposta imunológica do tipo celular. Já nos macrófagos, foram detectados aumento na liberação de IL-10, inibidora da resposta imunológica do tipo celular e ativadora de linfócitos B, e diminuição na liberação de MCP-1 e TNF, caracterizando uma resposta imunológica do tipo humoral. Estes resultados indicam que os corantes RR120 e RB19 podem ser nocivos quando em contato com o tecido cutâneo em concentrações acima de 500 ?g/ml. Nos permite concluir também que o potencial de uma substância química em causar respostas inflamatórias cutâneas possa ser previsto com testes in vitro, através da utilização de técnicas como microscopia de luz, microscopia eletrônica de varredura, testes bioquímicos básicos e citometria de fluxo, métodos alternativos a serem considerados na substituição à experimentação animal. Palavras-chave: corantes têxteis reativos; células de pele murina in vitro; respostas inflamatórias; exposição dérmica.Abstract: The skin, the largest organ of the human body, the main interface between the organism and the environment, constantly exposed to physical, chemical and biological factors. These interactions may occur exacerbated and harmful, resulting in adverse reactions, such as skin inflammation. Among the group of substances that may pose risks to human health through dermal exposure, have been the textile dyes. Numerous dyes have been used in fabric dyeing, however, studies have shown that various dyes groups commonly used are capable of inducing deleterious effects to the exposed organisms, for example, DNA damage and allergic reactions. The fact of garments may contain harmful chemicals and the knowledge that, even after repeated washings, the dyes are able to migrate and penetrate the skin in cases of heavy sweating, the need for better safety assessment of these products has proven relevant and immediacy. Alternative methods to animal experiments (in vitro methods), currently used to evaluate the harmful potential of different products, both by academia and industry. The objective of this study was to evaluate the cellular responses related to a possible inflammatory process of two textile dyes [Reactive Red 120 (RR120) - azo group and Reactive Blue 19 (RB19) - anthraquinone group] commonly used in the dyeing of cotton fibres. To mimic via of dermal exposure were used two murine cell lines, fibroblasts (BALB 3T3) and macrophages (RAW 264.7). To this end, after defining the range of toxic concentration of each dye test for cytotoxicity assays (MTT and NRU) were evaluated the production of reactive oxygen species (ROS) in conjunction with the detection and quantification of inflammatory cytokines. Determined the general condition of the skin cells by evaluation of cell morphology by techniques of light and scanning electron microscopy. For statistical analysis, we used the ANOVA followed by Tukey test. Cell cultures exposed to these dyes for 24 hours showed both through light microscopy and scanning electron, the dyes studied have cytotoxic action at concentrations above 500 ?g/ml. Both cell lines increased the release of ROS, most notably the RB19 dye. Detected the inflammatory action of RB19 and RR120 dyes in fibroblasts by increasing the release of Monocyte Chemoattractant Protein-1 proteins (MCP-1) and IL-6, featuring an immune response of cellular type. However in macrophages were detected increase in the release of IL-10, an inhibitor of immune response on the cell type and activating B-lymphocytes, and reduction in release of MCP-1 and TNF, featuring an immune response of humoral type. These results indicate that the RR120 and RB19 dyes can be harmful when in contact with the skin tissue at concentrations above 500 ?g/ml. Also allows us to conclude that the potential of a chemical to cause cutaneous inflammatory responses can be predicted with in vitro tests, using techniques such as light microscopy, scanning electron microscopy, basic biochemical tests and flow cytometer, alternative methods to consider in the replacement of animal experiments. Key words: reactive textile dyes; murine skin cells in vitro; inflammatory responses; dermal exposure