Caracterização funcional de genes de Herbaspirillum Seropedicae regulados pelo flavonóide naringenina

Orientadora : Profa. Dra. Rose Adele MonteiroCo-orientador : Prof. Dr. Emanuel M. de SouzaTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 2011Bibliografia: fls. 103-118Resumo: Herbaspirillum seropedicae é uma bactéria diazotrófica e endofítica, encontrada associada ao milho (Zea mays), arroz (Oryza sativa), sorgo (Sorghum bicolor), cana de açúcar (hibridos interespecíficos de Saccharum), e também à algumas espécies tropicais como a bananeira (Musa spp) e o abacaxizeiro (Ananas comosus). O H. seropedicae é uma bactéria promotora do crescimento vegetal (PGPR-Plant Growth Promoter Rhizobacteria), sendo portanto utilizada como biofertilizante. Tadra-Sfeir (2008), construiu uma biblioteca de mutantes aleatórios da estirpe SmR1 de Herbaspirillum seropedicae, que podem ser utilizados para determinar o padrão de expressão do gene mutado, em diferentes condições fisiológicas, devido a inserção do gene lacZ sem promotor. Cinco mil estirpes mutantes tiveram o seu padrão de expressão gênica testado na presença do flavonoide naringenina. Em vinte e duas estirpes mutantes a inserção do gene lacZ ocorreu em genes cuja expressão é regulada por naringenina. Dentre esses vinte e dois, foram encontrados genes que codificam para: proteínas envolvidas na biossíntese de exopolissacarídeos (EpsB) e lipopolissacarídeos (O-antígeno acetilase e aciltransferase); provável proteína membrana, glicosiltransferase e muropeptídeo permease. Dezesseis estirpes mutantes foram caracterizadas através da sua capacidade de formar biofilme e de colonizar epifiticamente e endofiticamente raízes de milho. O perfil eletroforético do LPS sintetizado pelas estirpes mutantes também foi analisado. O mutante MHS05, que possui mutação no gene ampG, apresentou perfil de LPS e estrutura do Lipídio-A diferente da estirpe selvagem SmR1 e também colonizou endofiticamente dez vezes menos raízes de milho do que a estirpe selvagem. Todos os genes com expressão diferencial na presença de naringenina foram validados por PCR em Tempo Real. Neste trabalho também foi utilizada a metodologia de seqüenciamento em larga escala (RNA-seq), utilizando o seqüenciador de nova geração SOLiD, para determinar o transcriptoma total de H. seropedicae na presença de naringenina. O RNA total foi extraído de células que cresceram na ausência (controle) e presença de naringenina (100 ?mol/L). Sessenta e seis milhões de leituras da amostra controle e 61 milhões da amostra naringenina foram obtidas, e destes 50 milhões de leituras (controle) e 47 milhões de leituras (naringenina) foram mapeados com o genoma de referência de H. seropedicae SmR1. As análises dos dados mostraram que 336 genes são regulados por naringenina, sendo 150 genes induzidos e 186 reprimidos pela presença do flavonóide. Dentre esses identificamos genes envolvidos no metabolismo de compostos aromáticos, como os genes pcaFJI, que são fortemente induzidos pela presença do flavonóide indicando que estes podem estar envolvidos com a degradação de naringenina em H. seropedicae.Abstract: Herbaspirillum seropedicae is a diazotrophic bacterium found in endophytic association with maize (Zea mays), rice (Oriza sativa), sorghum (Sorghum bicolor), sugar cane (Saccharum officiarum) and some tropical species like banana (Musa sp) and pineapple (Ananas comosus). The H. seropedicae is a plant growth promoter bacteria (PGPR - Plant Growth Promoter Rhizobacteria) and can be used as biofertilizer. Tadra-Sfeir (2008) constructed a mutant strains library using the SmR1 strain of H. seropedicae. These mutant strains can be used to determine the pattern of the mutated gene in differential physiological conditions due to insertion of lacZ gene without promoter region. Five thousand mutant strains were screened for differential expression in the presence or absence of naringenin. In twenty two strains the insertion of lacZ gene was found in genes that responded to naringenin. Among these twenty two strains found genes that code to: protein involved in exopolyssacharides biosynthesis (EpsB), lipopolyssacharides (O-antigen acetylase and acyltransferase), putative membrane protein, glycosyltransferase, and muropeptide permease (AmpG). Sixteen mutant strains were analysed by biofilm formation and epiphytic and endophytic colonization in maize roots. The mutant strains LPS profile was also analyzed. One mutant MHS05 (mutated gene codes a muropeptide permease (ampG)), presented the LPS profile and the fine structure of Lipid A different from the wild-type strain SmR1 and this same mutant colonize endophytically maize roots ten times less than the wild type. All the genes with differential expression in the presence of naringenin were validated by real time PCR. We also used a high-throughput sequencing based method (RNA-Seq) using the next-gene sequencer SOLiD to analyse the influence of naringenin on the whole transcriptome profile of H. seropedicae. Total RNA was extracted from cells grown in the absence (control) and presence of naringenin (100 ?mol/L). A total of 66 million reads of the control sample and 61 million of the test sample were obtained and out of these 50 million and 47 million in the control and test sample were mapped to the bacteria. Data analysis demonstrated that 336 genes are regulated by naringenin, 150 genes are induced and 186 are repressed. Genes involved in aromatic metabolism such as pcaFJI are strongly induced, indicate that these genes can be involved in naringenin degradation in H. seropedicae