Padronização de ensaio imunoenzimático para diagnóstico de vírus dos gêneros Flavivirus e Alphavirus

Orientadora : Drª. Claudia Nunes Duarte dos SantosTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 09/02/2015Inclui referênciasÁrea de concentração : Biologia Celular e MolecularResumo: Os flavivírus e alfavírus são vírus transmitidos por artrópodes (arbovírus) e representam um problema de saúde pública em vários países. A emergência e re-emergência dos arbovírus são fenômenos naturais relacionados à evolução e adaptação desses vírus. O Brasil, por ter grandes áreas recobertas por florestas tropicais, possui condições ideais para a ocorrência e manutenção do ciclo silvestre de diversas arboviroses. A crescente urbanização, o fluxo migratório, a destruição de habitats naturais e a presença de mosquitos dos gêneros Culex e Aedes favorecem a rápida disseminação desses vírus. Além disso, os sintomas iniciais das infecções causadas por esses vírus são semelhantes a outras infecções que ocorrem em diversas regiões do Brasil e não existe tratamento específico para essas viroses, nem vacina licenciada para uso humano. O diagnóstico laboratorial diferencial, portanto, é fundamental para o correto manejo clínico dos pacientes. Assim, este trabalho teve por objetivo padronizar ensaios imunoenzimáticos para o diagnóstico sorológico do vírus Chikungunya (CHIKV), pertencente ao gênero Alphavirus, e dos vírus da dengue (DENV), da encefalite de Saint Louis (SLEV) e do oeste do Nilo (WNV), pertencentes ao gênero Flavivirus. Para tanto, as proteínas E1 e E2 do CHIKV foram expressas em células S2 de Drosophila melanogaster e purificadas por cromatografia de afinidade. A proteína E2 (denominada rE2-CHIKV) apresentou melhores resultados durante sua expressão e purificação e foi selecionada para dar prosseguimento ao trabalho. Foram então gerados três hibridomas secretores de anticorpos monoclonais (AcM) contra esta proteína, os quais foram caracterizados como sendo do isotipo IgG1k. Nenhum dos AcM reconheceu os vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV), SLEV, WNV e DENV sorotipos 1 a 4. Foi padronizado um ensaio do tipo ELISA indireto utilizando a rE2-CHIKV como antígeno para a detecção de IgM anti-CHIKV, o qual apresentou sensibilidade de 70% e especificidade de 97% para o painel de amostras utilizado. Apesar da baixa sensibilidade, esses valores são comparáveis aos dos testes disponíveis comercialmente. O segundo vírus abordado nesse trabalho foi o vírus da dengue. Foram obtidos 22 AcM produzidos contra isolados brasileiros de DENV-1, -2 e -3. Os AcM são dos isotipos IgG2bk, IgG2ak e IgG1k, a maioria com especificidade para as proteínas de envelope ou pré-membrana do DENV. Quando testados contra os quatro sorotipos de DENV, diferentes padrões de reatividade foram identificados: grupo-específico, subcomplexo-específico (DENV-1, -3 e -4 ou DENV-2 e -3) e sorotipo-específico (DENV-2 ou -3). Além disso, alguns AcM apresentaram reatividade cruzada com vírus da febre amarela, WNV e SLEV, mas nenhum deles reconheceu o alfavírus VEEV. De acordo com nossos conhecimentos, esses são os primeiros AcM produzidos contra isolados brasileiros de DENV. O AcM denominado D3 424/8G, que apresentou reatividade com todos os flavivírus testados, foi conjugado com peroxidase e utilizado no desenvolvimento de um ensaio do tipo MAC-ELISA para detecção de IgM anti-DENV no soro de pacientes com infecção aguda por DENV. Como antígeno, foi utilizada uma mistura de DENV dos quatro sorotipos, produzidos em cultivo celular, purificados por colchão de sacarose e inativados por radiação gama. O ensaio apresentou sensibilidade de 91% e especificidade de 95% com as amostras testadas. No caso do SLEV, foram produzidas partículas-tipo vírus (VLP) em células HEK 293T. As SLE_VLPs, juntamente com o AcM D3 424/8G-HRP, foram utilizadas em um ensaio do tipo MAC-ELISA para diagnóstico de infecção aguda causada por SLEV. O teste desenvolvido apresentou sensibilidade de 95% e especificidade de 98% com o painel de amostras utilizado. Por fim, foram produzidas VLPs de WNV em células HEK 293T, as quais foram utilizadas na padronização de um ensaio do tipo MAC-ELISA para diagnóstico de infecção por WNV. Como conjugado, também foi utilizado o AcM D3 424/8G-HRP. No decorrer do trabalho, no entanto, foi obtida apenas uma amostra de soro de indivíduo com infecção aguda por WNV. Por isso, não foi possível calcular os valores de sensibilidade e especificidade do teste desenvolvido. Os insumos produzidos neste trabalho e os testes padronizados mostraram-se importantes ferramentas para serem utilizadas no diagnóstico dos vírus CHIKV, DENV, SLEV e WNV, além de poderem ser utilizados em pesquisa básica. Palavras-chave: Vírus Chikungunya. Vírus da dengue. Vírus da encefalite de Saint Louis. Vírus do oeste do Nilo. Proteínas recombinantes. Partículas-tipo vírus. Anticorpos monoclonais. Ensaio imunoenzimático. Diagnóstico.Abstract: The flavivirus and alphavirus are viruses transmitted by arthropods (arboviruses), which constitute a public health problem in many countries. The emergence and reemergence of arboviruses are natural phenomena related to species evolution and adaptation. Brazil has large areas covered by tropical forests, which provide ideal conditions for the existence and maintenance of the sylvatic cycle of many arboviruses. Increasing urbanization, migration, the destruction of natural habitats and the wide distribution of Culex and Aedes mosquitoes favor the rapid spread of these viruses. Furthermore, the initial symptoms of infections caused by these viruses are similar to other infections that occur in different regions of Brazil and there is no specific treatment for these viruses, nor licensed vaccine for human use. Laboratory differential diagnosis is therefore essential for the correct clinical management of patients. Therefore, this study aimed to develop enzyme immunoassays for the diagnosis of Chikungunya virus (CHIKV), belonging to the genus Alphavirus, and for the diagnosis of dengue virus (DENV), Saint Louis encephalitis virus (SLEV) and West Nile virus (WNV), belonging to the genus Flavivirus. For this, CHIKV E1 and E2 proteins were expressed in Drosophila melanogaster S2 cells and were purified by affinity chromatography. The E2 protein (named rE2-CHIKV) showed better results of expression and purification and was selected to continue the work. Three hybridomas secreting monoclonal antibodies (MAbs) against rE2-CHIKV were obtained. The MAbs were characterized as IgG1k isotype. None of the MAbs recognized the Venezuelan equine encephalitis virus (VEEV), SLEV, WNV and DENV serotypes 1 to 4. It was standardized an indirect ELISA for the detection of IgM anti-CHIKV using rE2-CHIKV as antigen, which had a sensitivity of 70% and specificity of 97%. Despite the low sensitivity, these values are comparable to those of commercially available tests. The second virus in this work was the dengue virus. Twenty two MAbs against Brazilian isolates of DENV-1, -2 and -3 were obtained. The MAbs include IgG2bk, IgG2ak and IgG1k isotypes, and most were raised against the envelope or the pre-membrane proteins of DENV. When the antibodies were tested against the four DENV serotypes, different reactivity patterns were identified: group-specific, subcomplex specific (DENV-1, -3 and -4 and DENV-2 and -3) and dengue serotype-specific (DENV-2 or -3). Additionally, some MAbs cross-reacted with yellow fever virus, WNV and SLEV. None of the MAbs recognized the alphavirus VEEV. To our knowledge, these are the first MAbs raised against Brazilian DENV isolates. The MAb D3 424/8G, which cross-reacted with all the flaviviruses tested, was conjugated to peroxidase and used to the development of a MAC-ELISA for detection of anti-DENV IgM in sera from patients with acute dengue. As antigen, we used a mixture of DENV particles serotypes 1 to 4, produced in cell culture, purified by sucrose cushion and inactivated by gamma radiation. The test had a sensitivity of 91% and a specificity of 95%. For SLEV, virus-like particles (VLPs) were produced in HEK 293T cells. The SLE_VLP together with the MAb D3 424/8G-HRP were used in the development of a MAC-ELISA for the diagnosis of acute infection caused by SLEV. The assay showed sensitivity of 95% and specificity of 98%. Finally, WNV VLP were produced in HEK 293T cells, and were used for standardizing a MAC-ELISA for the diagnosis of WNV infection. As conjugate it was also used MAb D3 424/8G-HRP. During the study, however, only one serum sample from patient with acute WNV infection was obtained. Therefore, it was not possible to calculate the sensitivity and the specificity of the test developed. The reagents produced and the diagnostic assays developed here have proved to be important tools to be used in the diagnosis of CHIKV, DENV, SLEV and WNV, and can be used for basic research. Keywords: Chikungunya virus. Dengue virus. Saint Louis encephalitis virus. West Nile virus. Recombinant proteins. Virus like particles. Monoclonal antibodies. Enzyme immunoassays. Diagnosis