Avaliação do efeito antinociceptivo da agregatina D isolada de Sinningia aggregata em camundongos

Orientador : Prof. Dr. Aleksander Roberto ZampronioDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Defesa: Curitiba, 26/09/2014Inclui referênciasResumo: Estudos anteriores desenvolvidos em camundongos demonstraram que o extrato bruto de Sinningia aggregata possui ação antinociceptiva na fase inflamatória do teste da formalina e na nocicepção induzida por carragenina. Analisando-se as frações obtidas desse extrato, demonstrou-se que parte dessa propriedade deve-se a presença de um novo composto heterocíclico, isolado da fração acetato de etila, denominado de Agregatina D. A Agregatina D quando localmente aplicada na pata dos animais nas doses de 0,7-7 ng, reduziu de maneira dose-dependente a nocicepção induzida pela carragenina (300 ?g/pata), com inibição máxima de 66%. Sabe-se que a aplicação intra-plantar de carragenina induz a sensibilização dos nociceptores por meio da liberação de uma cascata de mediadores como a bradicinina (BK) e as citocinas Fator de Necrose Tumoral ? (TNF-?) e Interleucina 1? (IL-1?) e da quimiocina Quimioatraente para Neutrófilos induzido por Citocinas 1 (CINC-1), seguindo-se os mediadores finais: os prostanóides e as aminas simpáticas. Então, seguindo essa sequência de mediadores, este estudo teve como finalidade elucidar o provável alvo da ação antinociceptiva da Agregatina D, avaliando a sensibilização dos nociceptores por meio dos filamentos de von Frey (0,008 à 2 g). A Agregatina D (7 ng/pata) inibiu significativamente em 55, 59 e 59%, a nocicepção induzida respectivamente pelas citocinas TNF-? (1 pg/pata), IL-1? (0,5 pg/pata) e CINC-1 (10 pg/pata). Em concordância com esses resultados houve redução significativa da nocicepção induzida pela BK (500 ng/pata, 84%), prostaglandina E2 (100 ng/pata, 64%) e dopamina (3 ?g/pata, 78%). Resultados similares foram encontrados com a dipirona (320 ?g/pata), com inibições de 57% para a BK, 76% para a prostaglandina E2 e 80% para a dopamina. Entretanto, diferentemente da dipirona, o composto na dose testada não modificou a nocicepção induzida pelo ativador da adelinato ciclase (forscolina, 1 ?g/pata), nem pelo análogo do AMPc (o dibutiril adenosina monofosfato cíclico, dbAMPc, 5 ?g/pata), indicando que sua ação ocorre provavelmente antes da ativação da via adelinato ciclase/AMPc nos nociceptores. Também observou-se que diferentemente da dipirona a ação antinociceptiva do composto não foi afetada pelo bloqueador seletivo de canais de potássio, a glibenclamida (80 ?g/pata). Avaliou-se ainda se o efeito antinociceptivo da Agregatina D poderia estar relacionado com inibição da liberação de NO. Para tanto, macrófagos peritoneais dos camundongos foram estimulados com lipopolissacarídeo (LPS) e tratados com o composto (4-4000 ng/mL) mas a Agregatina D não modificou esta resposta. Por fim, avaliou-se o efeito do composto no comportamento nociceptivo induzido pela aplicação de ativadores dos canais iônicos TRPV1, TRPA1, TRPM8 e ASIC, respectivamente capsaicina (0,1nmol/pata), cinamaldeído (10 nmol/pata), mentol (2,4 ?mol/pata) e ácido acético 2% em salina, pH 1,98 (20 ?L/pata) e o composto também não modificou estas respostas. A Agregatina D possui importante ação antinociceptiva, pois inibiu a nocicepção induzida pela carragenina, TNF-?, IL-1?, CINC-1, BK, prostaglandina E2 e dopamina. Acredita-se que sua ação seja entre a ativação do receptor acoplado à proteína G e a ativação da adenilato ciclase. Além disso, ela não parece atuar via inibição da atividade da proteína de translocação nuclear ?B, ativação de canais de potássio sensíveis à ATP ou através da interação com os principais canais iônicos envolvidos na nocicepção. Palavras-chave: Sinningia aggregata; Gesneriaceae; nocicepção; naftoquinona; Agregatin D.Abstract: Previous studies developed in mice showed that the crude extract of Sinningia aggregata has antinociceptive action in the inflammatory phase of formalin test and carrageenan-induced nociception. Analyzing the fractions obtained from this extract, it was demonstrated that this property is due to the presence of a new heterocyclic compound, isolated from ethyl acetate fraction, called Aggregatin D. Aggregatin D locally applied in the mice paw at doses of 0.7 to 7 ng reduced dose-dependently the nociception induced by carrageenan, with maximum innhibition of 66%. It is known that intraplantar application of carrageenan induces sensitization of nociceptors through the release of a cascade of mediators such as bradykinin (BK), the cytokine tumor necrosis factor-? (TNF-?) and interleukin-1? (IL-1?), and chemokine chemoattractant for neutrophils induced cytokine 1 (CINC-1), followed by final mediators: prostanoids and symphatetic amines. So, following this sequence of mediators, this study aimed to elucidate the probable target of antinociceptive Aggregatin D action, using von Frey monofilaments (0.008 - 2 g) to evaluate the sensitization of nociceptors. Aggregatin D (7ng/paw) significantly inhibited at 55, 59 and 59%, respectively, the nociception induced by TNF-? (1 pg/paw), IL-1? (0,5 pg/paw) and CINC-1 (10 pg/paw). In aggrement with these results there was a significant reduction of nociception induced by BK (500 ng/paw, 84%), prostaglandin E2 (100 ng/paw, 64%) and dopamine (3 ?g/paw, 78%). Similar results were found with dypirone (320 ?g/paw), with 57% inhibition for BK, 76% for prostaglandin E2 and 80% for dopamine. However, unlike dypirone, Aggregatin D did not modify the nociception induced by adenylyl cyclase activator (forskolin, 1 ?g/paw) or the analogue of cAMP (dibutyril adenosine monophosphat cyclic, dbAMPc, 5 ?g/paw), indicating that their action probably occurs prior to activation of the adenylyl cyclase/cAMP pathway in nociceptors. Unlike dypirone, Aggregatin D antinociceptive action was not affected by seletive potassium channels blocker, glibenclamide (80 ?g/paw). It was evaluated if the antinociceptive action of Aggregatin D could be related to innhibition of NO release. Peritoneal macrophages of mice were stimulated with lipopolysaccharide (LPS) and treated with the compound (4-4000 ng/mL) but Aggregatin D did not modify this response. Finally, we also analyzed the effect of Aggregatin D in the nociception induced by activating Transient Receptor Potential channels (TRP): capsaicin (0,1 nmol/paw, agonist TRPV1), cinnamaldehyde (10nmol/paw,TRPA1 agonist), menthol (2,4 mol/paw, TRPM8 agonist) and acidified saline (Acetic Acide 2% in saline, pH 1.98 in 20 ?L/paw, agonist ASIC) and the compound also did not modify this response. Our data shows that Aggregatin D posses an important antinociceptive activity, since it inhibited the nociception induced by carrageenan, TNF-?, IL-1? e CINC-1, bradykinin, prostaglandin E2 and dopamine. However, the compound was ineffective in the hyperalgesia induced by forskolin and by dbcAMP, suggesting that its action is between the G-protein coupled receptor activation and the adenilate cyclase activation. Besides, Aggregatin D does not seen to act through the inhibition of protein ?B nuclear translocation, ATP sensitive potassium channel activation or interaction with the main ion channels involved in nociception. Keywords: Sinningia aggregata; Gesneriaceae; Nociception; Naphtoquinone; aggregatin