Construção de vetores para caracterizaçao de genes de Trypanosoma cruzi em um sistema para clonagem em alta demanda

Orientador : Marco Aurélio KriegerDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 18/07/2008Inclui bibliografiaEm Trypanosoma cruzi, as informações provenientes do projeto genoma, o grande número de proteínas hipotéticas, as limitações da expressão protéica heteróloga em bactérias e a baixa quantidade de genes caracterizados constituem o cenário atual deste organismo. Esses fatores demonstram a necessidade da obtenção de ferramentas que permitam a caracterização em larga escala de genes deste organismo. Entre estas ferramentas, estão os vetores para expressão de proteínas em tripanossomatídeos, que, através da genética reversa, combinada com eficiência, plasticidade e compatibilidade permitem a caracterização de genes de forma rápida. Diante desta necessidade, foram construídos vetores para expressão de proteínas em Trypanosoma cruzi e Crithidia fasciculata que permitem a rápida clonagem de genes através do sistema Gateway® (Invitrogen). As construções para T. cruzi possuem a região 35.1 como intergênica, além de diferentes etiquetas (hexâmero de histidinas, c-myc, GFP, CFP, YFP e TAP), promotores (ribossomal de T. cruzi Dm28c e do bacteriófago T7) e resistências a antibióticos (higromicina e G418), permitindo a caracterização de genes por diversas abordagens. Além disso, a utilização de C. fasciculata como sistema de expressão protéica heteróloga tem como vantagens a sua proximidade evolutiva com T. cruzi e o fato de não parasitar seres humanos. Tal sistema é baseado nos vetores pNUS, com a adição do promotor do bacteriófago T7 e região operadora de tetraciclina. A validação desta plataforma foi realizada com 3 genes de T. cruzi, utilizando anticorpos contra as proteínas recombinantes para a confirmação da expressão, localização e obtenção de complexos protéicos. Os resultados obtidos demonstraram a funcionalidade e plasticidade dos vetores gerados, tornando factíveis as caracterizações gênicas em larga escala.The availability of the Trypanosoma cruzi genome is only a small piece of the puzzle of this parasite’s biology. A high percentage of hypothetical proteins, few genes characterized and limitations on heterologous protein expression are the present scenario for this biological model. Thus, the need for development of a highthroughput gene characterization platform becomes evident. Ideally, such platform should allow efficient cloning and disponibility of different applications. In this context, the goal of this study was to use the GatewayÒ technology (Invitrogen) to construct plasmid vectors suitable for different uses. Our constructs contained 35.1 intergenic regions, T. cruzi Dm28c 18S ribosome or the T7 bacteriophage promoters, antibiotic resistance genes, and several tags for multiple purposes. Besides T. cruzi vectors, a Crithidia fasciculata heterologous protein expression system was created based on pNUS-H1 and modified for use of the bacteriophage T7 RNA polymerase. The advantages of the C. fasciculata system are that it is related to T. cruzi but it is not pathogenic for humans. Three T. cruzi genes were used to validate our strategy. Antibodies against the products of these genes were used to detect the presence of the recombinant proteins in T. cruzi and C. fasciculata extracts, and to compare the localization of the native proteins with that of the recombinant proteins tagged with cmyc epitope or fluorescent proteins GFP, CFP and YFP in T. cruzi. The results obtained with these antibodies corroborated the results obtained with our system. TAP tag protein complex purification was also used for strategy validation. Our results show that this platform is a fast and efficient cloning system that allows the characterization of Trypanosoma cruzi genes by different biological approaches. The development of this high-throughput platform is a step further to large scale applications such as the T. cruzi ORFeome