Análise estrutural e funcional da região gInBA de Azospirillum brasilense

Orientador : Fabio de Oliveira PedrosaCo-orientadora : Roseli WassemDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 2005Inclui bibliografiaResumo: A fixação biológica de nitrogênio é a redução do nitrogênio atmosférico a amônio, catalisado pela nitrogenase. O metabolismo de nitrogênio é controlado por um complexo sistema regulatório denominado ntr, do qual fazem parte as proteínas PII e glutamina sintetase (GS). Em Azospirillum brasilense, a proteína GlnB (produto do gene glnB) atua como sinalizador dos níveis intracelulares de amônio, controlando a atividade de NifA, a qual é responsável pela ativação dos genes envolvidos na síntese do complexo da nitrogenase. A GS, produto do gene glnA, participa do sistema de assimilação do nitrogênio fixado, catalisando a síntese de glutamina, utilizando como substrato glutamato e amônio. O operon glnBA de A. brasilense foi identificado no plasmídeo pAB441, que foi isolado a partir de uma biblioteca genômica. Em experimentos de complementação genética com estirpes NifC de A. brasilense (HM26, HM053 e HM210) realizados por Vitorino (2001), observou-se que a presença do plasmídeo pAB441 leva a uma repressão completa da nitrogenase nestes mutantes, tanto na presença quanto na ausência de amônio. Com o objetivo de identificar os genes responsáveis por tal efeito foi construída uma biblioteca genômica do plasmídeo pAB441. Os insertos dos clones foram sequenciados e a análise da seqüência permitiu a identificação de dezessete ORF's na região do inserto do plasmídeo pAB441. Regiões deste inserto, exceto a região central, entre os sítios de restrição SacI/PstI, foram sub-clonadas para determinar seu efeito sobre a atividade da nitrogenase dos mutantes HM. Estas clonagens foram feitas em vetor estável em A. brasilense e a atividade de nitrogenase foi determinada nos mutantes contendo tais plasmídeos. Uma vez que o fenótipo NifC dos mutantes pode ser decorrente de mutações nos genes glnBA, este operon foi parcialmente seqüenciado nestas linhagens. Nas linhagens HM26 e HM210 foi detectada uma transversão C?T que levou à troca de uma glicina por cisteína na GS destes mutantes. Na HM26 a troca de aminoácido ocorreu na posição 53, correspondente ao sítio de ligação a amônio da GS enquanto na HM210 a troca deu-se na posição 129, o sítio de coordenação de íons metálicos. Ambas as mutações podem ser responsáveis pela baixa atividade biossintética de GS observada nestes mutantes