Isolamento, identificação e utilização de fungos nematófagos no controle das helmintoses em ovinos no Estado do Paraná

Orientadora : Profa. Dra. Vanete Thomaz SoccolCo-orientador : Prof. Dr. Carlos Ricardo SoccolTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Processos Biotecnológicos. Defesa: Curitiba, 17/09/2010Inclui referênciasÁrea de concentração: Saúde humana e animalResumo: A resistência dos nematóides a vários princípios ativos é atualmente o principal entrave na produção de pequenos ruminantes. O reflexo deste problema aliado a crescente preocupação com o meio ambiente, segurança alimentar e o bem estar animal teve implicações na produção agropecuária o que impulsionou na busca por tecnologias para a implantação de sistemas de produção sustentável. Desde então, métodos alternativos para o controle da verminose têm sido propostos e devem ser utilizados de maneira integrada a outros, como por exemplo, o controle biológico. Este tem por definição utilizar populações de organismos vivos já existentes na natureza para reduzir a população de organismos nocivos tornando-o menos abundante do que era anteriormente, diminuindo a fonte de infecção para os hospedeiros finais. A utilização de fungos nematófagos ou predadores, no controle biológico, tem se mostrado promissor. Assim, o objetivo deste trabalho foi isolar cepas nativas de fungos com atividade predatória para nematóides em solo paranaense, identificá-los, testar sua atividade contra larvas de tricostrongilídeos por testes in vitro, sua capacidade de sobrevivência á passagem pelo trato gastrintestinal de ovinos, estudar a interação do fungo nematófago com larvas infectantes de Haemonchus sp utilizando como ferramenta a microscopia eletrônica de varredura, avaliar a cinética de crescimento e produção de esporos do fungo isolado, utilizando meio de cultura com resíduos agroindustriais, testar a campo o método de pulverização de conídios na pastagem no controle das nematodioses em ovinos e avaliar o possível impacto ambiental sobre nematóides de vida livre e fitonematóides no solo. Das 56 amostras de solos provenientes de várias mesorregiões do Estado do Paraná, foram isoladas duas cepas com atividade predatória: Arthrobotrys musiformis e Arthrobotrys conoides. No teste in vitro realizado contra larvas de tricostrongilídios em placas de Petri o isolado Arthrobotrys conoides atingiu 96,35% de eficiência e o Arthrobotrys musiformis de 85,75%. No outro teste in vitro, realizado com a adição de diferentes concentrações de conídios, o isolado Arthrobotrys conoides teve eficácia contra larvas infectantes (L3) em 91% quando comparado com o Arthrobotrys musiformis (81%). Ambas as cepas mostraram ser resistentes a passagem pelo trato gastrintestinal em ovinos. No estudo da interação fungo e nematóide, pela microscopia eletrônica de varredura observou-se claramente todo o processo de predação desde a formação de armadilhas do tipo redes adesivas tridimensionais, captura, prolongamento no bulbo de infecção do fungo sugerindo ser utilizado para perfurar a cutícula do nematóide no momento da sua penetração, diminuição do turgor e a presença da hifa no interior do corpo da larva, confirmando a atividade predatória da cepa de Arthrobotrys conoides contra larvas infectantes de Haemonchus sp. No teste de cinética de crescimento, verificou-se que a velocidade de crescimento do fungo em meio contendo casca de soja foi superior (0,50 mm h-1) quando comparado com o meio contendo farelo de trigo (0,45 mm h-1), porém a produção de conídios em farelo de trigo foi de 2,19 x 106 conídios mL-1 maior quando comparado a casca de soja (1,13 x 106 conídios mL-1). A avaliação do controle biológico foi realizada nos meses de maio a setembro de 2009, período em foi pulverizado esporos na pastagem. Os parâmetros avaliados foram contagem de larvas infectantes (L3) na pastagem; taxa de infecção de animais sentinelas monitorados pela contagem de ovos de helmintos por grama de fezes (OPG) e pelo número de nematóides do solo. O número de larvas de helmintos nas pastagens reduziu significativamente com média de redução em 52,4% no final do experimento quando comparado ao grupo controle, diferindo estatisticamente entre si. O ganho de peso dos animais não diferiu estatisticamente.Abstract: Control of gastrointestinal nematodes infection in small ruminants has been a problem because of resistance of parasites to different active ingredients. The reflection of this problem coupled with growing concern about the environment, food safety and animal welfare had implications for agricultural production which has fueled the search for technologies for the implementation of sustainable production systems. Since then, alternative methods to control the worms have been proposed and should be used in an integrated manner to other methods, such as biological control, which is defined using populations of living organisms already existing in nature, to reduce the population of pests, making it less abundant than previously, reducing the source of infection for the final host. The use of nematophagous fungi as biological control has shown promise. The objective this work was to isolate native strains of nematophagous fungi in soils from Paraná, identify them, test their predatory activity in vitro against larvae trichostrongyles, their ability to survive passage through the gastrointestinal tract of sheep, to study the interaction of the nematophagous fungus larvae infective Haemonchus sp using the tool with scanning electron microscopy to evaluate the kinetics of growth and sporulation of the fungus Arthrobotrys conoides using culture medium with agro-industrial residues, field test the method of spraying conidia on pasture in nematodiosis control in sheep and to evaluate the possible environmental impact on free-living nematodes and phytonematodes in soil. Of the 56 soil samples from various regions of Paraná, were isolated from two strains with predatory activity: Arthrobotrys musiformis and Arthrobotrys conoides. In vitro tests conducted against larvae in Petri dishes trichostrongyles isolate Arthrobotrys conoides reached 96.35% efficiency and Arthrobotrys musiformis of 85.75%. In another in vitro test performed with the addition of different concentrations of conidial isolate Arthrobotrys conoides reduced 91% of infective larvae (L3) when compared with Arthrobotry smusiformis (81%). Both strains were shown to be resistant to passage through the gastrointestinal tract in sheep. In the study of fungus x nematode interaction, using as tool the scanning electron microscopy made it possible to clearly observe the entire process from the predation of formations traps dimensional adhesive networks, capture, extending the bulb of the fungus suggests be used to drill the cuticle of the nematode in the moment of penetration of the fungus, decreased turgor and the presence of hyphae inside the body of the larva, confirming the strain of the predatory activity of Arthrobotrys conoides against infective larvae of Haemonchus sp. In the kinetic test, we used the culture media prepared with 5% for the two residues tested, wheat bran and soybean hulls plus 1.5% agar L-1 and found that the speed of fungal growth on medium containing soybean hulls was higher (0.50 mm h-1) compared with the medium containing wheat bran (0.45 mm h-1), however the production of conidia on wheat bran was 2.19 x 106 conidia mL-1 higher compared to soybean hulls. The evaluation of biological control was carried out between May to September 2009, period in which spores were sprayed on pasture. The parameters were counting of infective larvae (L3) on pasture; rate of infection of sentinel animals monitored by counting eggs per gram faeces (OPG) and the number of soil nematodes. The number of nematodes larvae in pastures significantly decreased in May, July and August, with a mean reduction of 52.4% at the end of the experiment compared with the control group, differences among them. We observed the largest reductions in FEC in July (51.4%) and August (56.4%), leaving the overall average in 49.1% when compared to control. The weight gain of animals did not differ statistically