Caracterização de enzima nad sintetase (NADE2) de herbaspirillum seropedicae

Orientadora : Prof. Dr. Luciano Fernandes HuergoCo-orientador : Profª Drª. Vivian Rotuno Moure e Prof. Dr. Marco A. S. de OliveiraDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 21/03/2016Inclui referências : f. 77-83Resumo: A enzima nicotinamida adenina dinucleotídeo sintetase (NadE) catalisa a amidação do ácido nicotínico adenina dinucleotídeo (NaAD) para formar NAD+. Essa reação é o último passo da biossíntese de NAD, e portanto é uma enzima chave no metabolismo. Enzimas NadE tipicamente usam glutamina ou amônia como doadores de nitrogênio, em uma reação dependente de ATP. Dada a função de NadE para o metabolismo de procariotos, NadE vêm atraindo interesse como alvo para antibióticos. Em vários organismos, podem ser encontradas várias cópias de genes que codificam para NAD sintetases. A bactéria associativa de plantas Herbaspirillum seropedicae possui dois genes que codificam para duas enzimas NadE1 e NadE2. O gene nadE1 é ligado por contexto genômico ao gene glnB que codifica para a proteína transdutora de sinal GlnB. Anteriormente a NadE1 foi caracterizada cineticamente, e ela mostrou ter preferência por glutamina. Este trabalho mostra a confirmação da preferência de glutamina por NadE1 por ensaio de LC/MS, assim como a caracterização da proteína NadE2 de H. seropedicae. Após a clonagem, expressão e purificação da proteína NadE2, a análise de cromatografia de gel filtração sugere que NadE2 é uma enzima homo-dimérica. A caracterização cinética de NadE2 indica que seu domínio glutaminase é funcional, porém há preferência por glutamina em relação a amônia é sutil. Essa é a primeira investigação cinética de uma enzima glutamina-dependente dimérica. Palavras chave: NAD+, glutaminase, enzima.Abstract: Nicotinamide adenine dinucleotide synthetase enzyme (NadE) catalyzes the amidation of nicotinic acid adenine dinucleotide (NaAD) to form NAD+. This reaction is the last step of NAD biosynthesis, therefore is a key enzyme of metabolism. NadE enzymes typically use glutamine or ammonium as nitrogen donors in an ATP-dependent reaction. Given the NadE function to prokaryote metabolism, it has attracted interest as a potential target for novel antibiotics. In several organisms, it is possible to find several copies of genes that codify to NAD synthetases. The plant associative bacterium Herbaspirillum seropedicae has two genes that encode for two different NAD synthetases, NadE1 and NadE2. The nadE1 gene is genetically linked to glnB, encoding the signal transduction protein GlnB. Previously, NadE1 was characterized kinetically, and it shows preference for glutamine. In this work, the preference for glutamine is confirmed by LC/MS assay, as well as the characterization of H. seropedicae NadE2. After cloning, expression and purification of NadE2, gel filtration chromatography analysis suggests that NadE2 is a homodimer. Kinetic characterization of NadE2 indicates a functional glutaminase domain, although the preference for glutamine vs ammonium as nitrogen donor was only modest. This is the first biochemical characterization of a dimeric glutamine-dependent NAD synthetase. Keywords: NAD+, glutaminase, enzyme