Tecnologia de Phage Display no mapeamento de mimetopos de Haemonchus contortus e uso de RNA de interferência no silenciamento do gene codificante da proteína gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) do parasita

Orientador: Prof. Dr. Marcelo Beltrão MolentoCoorientador: Prof. Dr. Amilcar Arenal CruzTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias. Defesa : Curitiba, 12/04/2018Inclui referênciasResumo: Haemonchus contortus é um nematoda hematófago de pequenos ruminantes, extremamente importante em escala mundial, sendo responsável por muitos danos à saúde dos animais, além de perdas produtivas e econômicas aos criadores. O panorama atual é de resistência do parasita à maioria das classes de anti-helmínticos disponíveis no mercado, o que demonstra necessidade urgente de métodos alternativos de controle. Portanto, os objetivos deste estudo foram selecionar mimetopos de H. contortus e avaliar o uso de RNA de interferência no silenciamento do gene codificante da proteína gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) do parasita. A presente tese está dividida em 3 capítulos apresentados na forma de introdução geral e 2 manuscritos. O manuscrito 1 consistiu no uso de anticorpo policlonal de ovinos para mapear mimetopos de H. contortus usando a biblioteca de phage display. O clone 6 - mimetopo de GAPDH e clone 17 - mimetopo da família do músculo desorganizado (Dim 1) foram selecionados para ensaio de imunização de ovinos. Peptídeos mimetopos (sintéticos) foram avaliados como moléculas antigênicas por meio de ensaio imunoenzimático (ELISA). No ensaio de imunização constatou-se aumento dos títulos de IgG anti-fago M13, mas não ocorreu aumento de IgG anti-peptídeos mimetopos. Os peptídeos mimetopos sintéticos foram reconhecidos por IgG de ovinos naturalmente infectados por H. contortus. Este é o primeiro relato de uso bem sucedido da biblioteca de phage display para a identificação de mimetopos de H. contortus. O manuscrito 2 teve o objetivo de avaliar o uso de RNA de interferência (RNAi) para silenciamento do gene codificante da proteína GAPDH de H. contortus. Larvas infectantes foram incubadas com RNAi por 3; 6; 24 e 48h. Os resultados revelaram ausência de transcrição gênica em todas os períodos avaliados. Este estudo relata pela primeira vez o silenciamento de GAPDH em H. contortus, confirmando o gene como passível ao silenciamento por RNAi. Os dados expostos nesta tese apontam resultados promissores para uso em novas pesquisas voltadas ao desenvolvimento de terapias para o controle de H. contortus. Palavras-chave: Pequenos ruminantes; ovinos; resistência parasitária; RNA de interferência.Abstract: Haemonchus contortus is a hematophagous nematoda of small ruminants, extremely important on a worldwide scale, being responsible for severe impact to the animal's health, besides productive and economic losses to the breeders. The current panorama is parasite resistance to the most anthelminthics classes commercially available for its control. This demonstrates the urgent need of alternative control methods. Therefore, the goals of this study were to select mimotopes from H. contortus and to evaluate the use of RNA interference (RNAi) to silence the gene glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) of the parasite. This thesis is divided into 3 chapters presented as 1 general introduction and 2 manuscripts. The goal of the first manuscript was to evaluate polyclonal antibody to map H. contortus mimetopos using the phage display library. Clone 6 - GAPDH mimetope and clone 17 - mimetope from the disorganized muscle family (Dim 1) were selected for sheep an immunization assay. Peptide mimotopes (synthetic) were evaluated as antigenic molecules by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In the immunization assay, IgG titers anti-phage M13 showed increase, but IgG anti-peptide mimotopes did not increased. Peptide mimotopes (synthetic) were recognized by IgG from sheep naturally infected by H. contortus. This is the first report of successful use of the phage display library for identification of H. contortus mimotopes. The aim of the manuscript 2 was to evaluate the RNAi to silence the GAPDH gene of H. contortus. Infective larvae were incubated with RNAi for 3; 6; 24 and 48h. The results showed absence of gene transcription in all evaluated periods. This study reports for the first time the silencing of GAPDH gene in H. contortus, confirming the gene as susceptible to silencing by RNAi. The data presented in this thesis point out promising results for use in new researches to development H. contortus control therapies. Key-words: Small ruminants; sheep; parasite resistance; RNA interference