Polissacarídeos do cogumelo Macroocybe titans : caracterização estrutural e atividade biológica

Orientador : Prof. Dr. Marcello IacominiCoorientadora : Profª. Drª. Fhernanda Ribeiro SmiderleDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 21/08/2017Inclui referências : f. 86-100Resumo: O cogumelo gigante Macrocybe titans assim como os demais basidiomicetos, desperta o interesse científico devido a sua possível bioatividade, em parte decorrente da presença de polissacarídeos com variadas características estruturais. Com base nisto, o presente trabalho teve por objetivo elucidar a estrutura química de alguns polissacarídeos presentes no basidioma de M. titans, bem como verificar seu efeito biológico frente a células de melanoma murino B16F10. Para isto, o corpo de frutificação do basidiomiceto seco, moído e deslipidificado foi submetido à processos sucessivos de extrações aquosas (a frio e a quente) e alcalina (NaOH 5%). Os extratos aquosos foram precipitados com etanol e dialisados contra água destilada, enquanto que o extrato alcalino foi neutralizado e dialisado contra água corrente. O extrato obtido a frio foi purificado por tratamento com ?-amilase, congelamento e degelo e diálise em membrana (1.000 kDa). O extrato a quente foi fracionado por congelamento e degelo, tratamento com ?-amilase e tratamento com Me2SO. O extrato alcalino, por sua vez, foi purificado por congelamento e degelo, tratamento com solução de Fehling ou NaOH 2% seguido de precipitação com ácido acético. A fração E1000, obtida do extrato a frio apresentou-se homogênea, sendo composta por galactose e fucose e contendo uma massa molar estimada em 14,2 x 103 g/mol. As análises de espectroscopia e metilação sugerem que esta molécula seja uma fucogalactana com uma cadeia principal composta por ?-D-Galp ligadas (1?6), substituída a cada 2 ou 3 unidades em O-2 por terminais não redutores de ?-L-Fucp. A atividade biológica desta molécula, bem como da fração bruta R6CW obtida do extrato a frio, foi avaliada em células de melanoma murino B16F10, sendo que a fração R6CW aumentou a capacidade endocítica do corante vermelho neutro pelas células em 48 h na concentrações de 10 e 50 ?g/mL, enquanto que a proliferação celular foi aumentada em todas as concentrações testadas em 48 h. A fucogalactana, por sua vez, não causou alteração na viabilidade celular e alterou a proliferação célular apenas na concentração de 50 ?g/mL em 72 h de tratamento. A fração SSD, obtida do extrato a quente, apresentou-se composta por mais de uma molécula, contendo principalmente glucose, galactose, manose e fucose. A análise espectroscópica indicou a presença de ?-D-Glcp, ?-D-Manp, ?-L-Fucp e ?-D-Galp nesta fração, que será submetida a outras etapas de fracionamento visando a purificação da mesma. As frações SFSEA e SSIEA, obtidas do extrato alcalino, apresentaram principalmente glucose em sua composição monossacarídica. Ambas as frações ao serem analisadas por espectroscopia, apresentaram sinais correspondentes à uma ?-D-Glucana contendo uma cadeia principal formada por unidades de ?-D-Glcp ligadas (1?3), ramificada em O-6 por ?-D-Glcp, o que foi confirmado pela degradação controlada de Smith, em que o material resistente à degradação apresentou sinais correspondentes à ?-D-Glcp ligada (1?3). A análise de metilação da fração SSIEA mostrou que a glucana presente nesta fração é substituída em O-6 na proporção de 1:1, podendo estas substituições serem tanto por unidades de ?-D-Glcp quanto por cadeias laterais de ?-D-Glcp ligadas (1?6). A fração SFSEA será submetida a análise de metilação visando a elucidação da sua estrutura química. Palavras-chaves: Macrocybe titans; Glucana; Fucogalactana; Atividade biológica.Abstract: The giant mushroom Macrocybe titans, as well as the other basidiomycetes, arouse the scientific interest due to its possible bioactivity, in part due to the presence of polysaccharides with a varied chemical structures. Based on this, this work aimed to elucidate the chemical structure of some polysaccharides of M. titans fruiting bodies, as well as evaluate its biological activity on murine melanoma cells (B16F10). Therefore, the dried, powdered and defatted fruiting bodies were submitted to successive aqueous (cold and hot) and alkaline (NaOH 5%) extractions. The aqueous extracts were precipitated with ethanol and dialyzed against distilled water, while the alkaline extract was neutralized and dialyzed against tap water. The cold water extract was purified by ƒ¿-amylase treatment, freeze and thawing process and dialysis through membrane (1,000 kDa). The hot water extract was fractionated by freeze and thawing process, ƒ¿-amylase treatment and Me2SO treatment. The alkaline extract, on its turn, was purified by freeze and thawing, treatment with Fehling solution or with NaOH 2% followed by precipitation with acetic acid. The E1000 fraction, obtained from cold water extract, was pure and contained galactose and fucose, and an estimated molar mass of 14.2 x 103 g/mol. The spectroscopy and methylation analyses suggest that this molecule is a fucogalactan with a main chain composed of ƒ¿-D-Galp (1¨6) linked, branched at O-2 position by non reducing end units of ƒ¿-L-Fucp in the proportion of 2 to 3 units. The biological activity of this molecule, as well as the crude fraction R6CW obtained from the cold water extract, was evaluated in B16F10 cells. The R6CW fraction increased the cell endocytic capacity in 48 h at 10 and 50 ƒÊg/mL, while the cell proliferation was increased in 48 h at all concentrations tested. On the other hand, the fucogalactan did not cause changes in the cell viability, and altered the proliferation only at 50 ƒÊg/mL in 72 h of treatment. The SSD fraction, obtained of hot water extract was composed of more than one molecule and contained maily glucose, galactose, mannose, and fucose. The spectroscopic analyses indicated the presence of ƒÀ-D-Glcp, ƒ¿-D-Manp, ƒ¿-L-Fucp and ƒ¿-D-Galp in this fraction, that will be submitted to other purification steps aiming its purification. The fractions SFSEA and SSIEA, obtained from alkaline extract, presented mainly glucose as monosaccharides. Both fractions, when analyzed by spectroscopy showed signals corresponding to a ƒÀ-D-glucan containing a main chain composed of ƒÀ-D-Glcp (1¨3) linked, branched at O-6 position by ƒÀ-D-Glcp, which was confirmed after Smith degradation, which generated a resistant fraction with signals corresponding to the ƒÀ-D-Glcp (1¨3)-linked. The methylation analysis of SSIEA suggested that the ƒÀ-glucan present in this fraction is branched at a rate of 1:1, and the side chains can be composed by ƒÀ-D-Glcp units or ƒÀ-D-Glcp (1¨6)-linked chains. The SFSEA fraction will be subjected to methylation analysis to determine its chemical structure. Keywords: Macrocybe titans; Glucan; Fucogalactan; Biological activity