Caracterização biológica e bioquímica e análise estrutural das isoformas de fosfolipases-d LiRecDT 1, LiRecDT 2, LiRecDT 3 e LiRecDT 1 h12a do veneno de Loxosceles intermedia obtidas pela expressão recombinante em Escherichia coli BL21(DE3)plysS E Escherichia coli SHuffle T7 Express lysY

Orientador : Prof. Dr. Silvio Sanches VeigaCoorientadora : Profª. Drª. Olga Meiri ChaimDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 27/02/2013Bibliografia: fls 105-118Resumo: A partir do veneno de L. intermedia várias toxinas foram clonadas e vêm sendo caracterizadas bioquímica e biologicamente. Dentre as toxinas clonadas estão as fosfolipases-D que são responsáveis pela maioria dos efeitos biológicos causados pelo veneno, porém, a ação desta e das demais toxinas parece depender de uma ação combinada ou sinérgica que resulta no loxoscelismo. Loxoscelismo é a denominação do quadro clínico provocado em pacientes picados por aranhas do gênero Loxosceles. Até o momento, sete isoformas de fosfolipases-D foram clonadas e parcialmente caracterizadas. Todas essas isoformas recombinantes de fosfolipases-D, com exceção da mais recente, foram expressas na cepa bacteriana E. coli BL21(DE3)pLysS que não possui controle ou auxilio na formação de pontes dissulfeto intracadeia polipeptídica. Utilizando a primeira isoforma obtida (LiRecDT1), foi demonstrado a partir de cristalografia que essa enzima possui quatro cisteínas na sua cadeia polipeptídica que formam duas pontes dissulfeto e que essas pontes têm relação com a atividade das fosfolipases-D e com a sua estrutura terciária. Todas as sete isoformas possuem estas cisteínas conservadas e mesmo havendo também uma relevante conservação aminoacídica no sítio catalítico das isoformas de fosfolipases-D, o restante dos aminoácidos das sequências varia o suficiente para contribuir em mudanças nos níveis de atividade e solubilidade entre elas. Assim, sabendo-se que alterações nas estruturas podem interferir na intensidade das suas atividades, bem como na solubilidade em ambientes biológicos, realizamos a expressão de quatro isoformas (LiRecDT1, LiRecDT2, LiRecDT3 e LiRecDT1 H12A) na cepa até então utilizada e na cepa E. coli SHuffle T7 express LysY, que auxilia na formação de pontes dissulfeto e possui ambiente favorável a proporcionar opções de dobramentos alternativos às proteínas recombinantes. Essas quatro isoformas produzidas em ambas às cepas foram então purificadas e submetidas a ensaios de cunho bioquímico e biológico. Estes ensaios foram realizados com o intuito de serem realizadas comparações para avaliar se haveriam mudanças nos níveis de atividade e/ou solubilidade até então conhecidos para as quatro isoformas escolhidas. Todos os resultados mostraram não haver diferenças estatisticamente significantes nos níveis de atividade para as toxinas testadas, embora expressas em cepas diferentes. Entretanto, algumas características da nova cepa contribuíram para a diminuição do rendimento final de purificação quando comparadas com as purificadas a partir da outra cepa. A predição estrutural acabou revelando novas questões que certamente se tornarão alvos de estudo para melhor compreensão da atividade dessas enzimas. Estre trabalho indicou que embora produzidas nesta nova cepa que possui refinamento para proporcionar um melhor dobramento, estas toxinas já estavam obtendo sua conformação correta espontaneamente quando produzidas na cepa bacteriana E. coli BL21(DE3)pLysS até então utilizada.Abstract: From the venom L. intermedia various toxins were cloned and has been characterized biochemical and biologically. Loxoscelism is the name of the clinical picture provoked in patients bitten by Loxosceles spiders. Among the cloned toxins are the phospholipases-D, that are responsible for most of the biological effects caused by the poison, however, the action of this and other toxins seems to depend on a combined or synergistic action that results in loxocelism. To date seven phospholipase-D isoforms have been cloned and partially characterized. All these recombinant isoforms of phospholipase-D, except the most recent, were expressed in the bacterial strain E. coli BL21(DE3)pLysS that has no control or aid in forming intrachain polypeptide disulfide bonds. Using the first isoform obtained (LiRecDT1) X-ray diffraction crystallography has allowed to demonstrate that this enzyme has four cysteines in its polypeptide chain that form two disulfide bonds, and that these bonds are related to the phospholipase-D activity and its tertiary structure. All of the seven isoforms possess these cysteines conserved and also while there is significant amino acids conservation in the catalytic site of the phospholipases-D isoforms, the remaining amino acid sequence varies enough to contribute to changes in activity levels and solubility among them. So, knowing that changes in the structures can interfere in the intensity of their activities, as well as solubility in biological environments, we performed the expression of four isoforms (LiRecDT1, LiRecDT2, LiRecDT3 LiRecDT1 and H12A) in the strain so far used and in the E. coli SHuffle T7 Expression LysY strain, which aids in the disulfide bonds formation and has favorable environment to provide alternative options to the recombinant protein folding. These four isoforms produced in both strains were then purified and subjected to biological and biochemical tests. These assays were performed with the intention to be performed comparisons to assess whether there would be changes in activity levels and/or solubility so far known for the four isoforms chosen. All results showed no statistically significant differences in activity levels for the tested toxins, although expressed in different strains. However, some features of the new strain contributed to the decrease in the final yield of purification when compared with the proteins purified from the other strain. The structural predctions eventually revealed new questions that surely will become targets of study to better understand the activity of these enzymes. This work indicates that although produced on this new strain that has refinement to provide an improved folding, these toxins were already getting their correct conformation spontaneously when produced in the bacterial strain E. coli BL21(DE3)pLysS so far used