Estudo do papel de eIF5A na síntese proteica

O provável fator de início de tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado de arqueas a mamíferos e sofre uma modificação pós-traducional única e essencial, em que uma lisina específica é convertida em um resíduo de hipusina. Este fator já foi relacionado a início de tradução, transporte nucleocitoplasmático, decaimento de mRNA e proliferação celular, mas a função crítica de eIF5A na célula ainda não foi totalmente esclarecida. Ainda que o papel de eIF5A na tradução geral tenha sido questionado, dados recentes de nosso laboratório, incluindo os resultados deste trabalho, restabelecem uma função para eIF5A na tradução e evidenciam a sua atuação na etapa de elongação ao invés de início. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi ampliar os estudos do papel de eIF5A na síntese proteica. Para isso, foram realizadas análises de interação genética e de perfil polissomal de linhagens que combinam o alelo mutante de eIF5A, tif51A-3, e de fatores envolvidos na etapa de início (eIF4E, eIF3 e eIF5B) ou elongação (eEF2) da tradução. As análises de perfil polissomal utilizando mutantes duplos de eIF5A e de fatores de início de tradução mostram uma diminuição do efeito de perda de polissomos característico de mutantes de início de tradução. Além disso, o perfil polissomal de mutantes de eIF5A é bastante semelhante ao do mutante de elongação. Foi também observado que a depleção de eIF5A provoca uma diminuição significativa na síntese proteica total e um aumento no tempo de trânsito ribossomal, confirmando os resultados obtidos nas análises de perfil polissomal. Também foi avaliada a influência de eIF5A no processo de elongação da tradução utilizando-se repórteres contendo a IRES do vírus CrPV, a qual é independente de todos os fatores de início de tradução conhecidos. Foi observada uma diminuição...The putative eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A) is highly conserved from archaea to mammals, essential for cell viability and it is the only cellular protein known to contain the essential amino acid hypusine. eIF5A has also been involved with nucleocitoplasmatic transport, mRNA decay and cell proliferation, however its critical function in the cell is not completely understood. Although a role for eIF5A in general translation has been questioned, our recent findings, including those described in this study, showed that eIF5A has a function in protein synthesis and it is related with the elongation step of translation instead of initiation. Therefore, the aim of this study was to investigate the role of eIF5A in protein synthesis. For this purpose, we tested genetic interactions and performed polysomal profile analysis of yeast strains that combine the eIF5A mutant tif51A-3 with translation initiation (eIF4E, eIF3 and eIF5B) or elongation (eEF2) mutants. The polysome profile analysis of the double mutants of eIF5A and canonical initiation mutants showed a decrease in polysome run-off. In addition, the polysome profile of eIF5A mutant is quite similar to that of the eEF2 mutant. Also, we observed that the depletion of eIF5A causes a significant decrease in total protein synthesis and an increase of the average ribosomal transit time. These results are in agreement with the polysome profile data. The influence of eIF5A in translation elongation was also evaluated using reporters containing the CrPV IRES, which is independent of all factors known to be involved in translation initiation. We observed a decrease in IRES activity in the eIF5A and eEF2 mutants, when compared to the wild type. In addition, two other conditional eIF5A mutants (tif51AK56A and tif51AQ22H/L93F) which produce stable eIF5A at the restrictive temperature were also analyzed... (Complete abstract click electronic access below)Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP