Glycine dependent neurotransmission and neuropathic pain

Das Schmerzempfinden stellt eine wichtige Warnfunktion des Körpers dar und schützt ihn vor potentiellen Schäden. Chronische Entzündungen, systemische Erkrankungen oder Läsionen im peripheren oder zentralen Nervensystem können zu einer pathologischen nozizeptiven Hyperaktivität, auch sogenannten neuropathischen Schmerzen führen. Dies äußert sich in einer spontanen und/oder übermäßiger Schmerzantwort auf nicht schmerzhafte oder leichte Stimuli (Allodynie bzw. Hyperalgesie). Die Therapie von neuropathischen Schmerzen ist oftmals schwierig und unzureichend. Es konnte gezeigt werden, dass die spinale Disinhibierung der glycinergen Neurotransmission im Rückenmark einer der Hauptgründe für die Entwicklung von neuropathischen Schmerzen darstellt. Der Glycintransporter 1 (GlyT1) spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation der extrazellulären Glycinkonzentration und bietet damit eine Ansatz um die glycinerge Inhibierung im Rahmen der Schmerzweiterleitung zu modulieren. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht ob der spezifische, reversible GlyT1 Inhibitor Bitopertin in der Einzeldosis, als auch in der Langzeitapplikation, positive Effekt im neuropathischen und inflammatorischen Schmerzmodell in der Maus aufweist, und damit eine mögliche neue Therapieoption für chronische neuropathische Schmerzen darstellt. Die Induktion von neuropathischen Schmerzen erfolgte durch eine chronic constriction injury (CCI) des linken Ischias Nervs, die Induktion von inflammatorischen Schmerzen durch die Injektion von Carrageenan in die linke Hinterpfote. Die Entstehung von mechanischer Allodynie und thermaler Hyperalgesie wurde mit einem Dynamic Plantar Aesthesiometer bzw. mit einem Hargreaves Apparat bestimmt. Um die allgemeine Aktivität und das Explorationsverhalten zu bestimmen erfolgten Openfield Experimenten. Die Glycinkonzentration in Cerebrospinal Fluid (CSF) und Blut wurde mittels HPLC analysiert. Eine Einzeldosis Bitopertin reduziert signifikant mechanische Allodynie und thermische Hyperalgesie im neuropathischen und inflammatorischen Schmerzmodell ohne akuten Schmerz zu beeinflussen. Die Langzeitapplikation mittels osmotischen Pumpen führte zu einem stabilen antinozizeptiven Effekt über vier Wochen. Weder Einzel- noch Langzeitapplikation führte zu unerwünschten Nebeneffekten bezüglich der Motoraktivität und/oder des Angstverhaltens. In naiven Mäusen konnte weder in der Einzel-, noch in der Langzeitapplikation negative Effekte beobachtet werden. Des Weiteren führte Bitopertin zu einem signifikanten Anstieg der Glycinkonzentration in CSF, während die Konzentration im Blut unverändert blieb. Während der Langzeitapplikation mit Bitopertin konnten keine Veränderungen hinsichtlich der Hämoglobinsynthese beobachtet werden. Zusammenfassend ergeben die Ergebnisse, dass die indirekte Modulation der glycinergen Neurotransmission mit dem GlyT1 Inhibitor Bitopertin ein vielversprechender Ansatz für die Behandlung von chronischen Schmerzen, bzw. für die weitere Entwicklung potentieller Medikamente in diesem Kontext darstellt. Zusätzlich zu Wildtyp (WT) Mäusen wurden konditionale GlyT1(fl/fl) / GFAP Cre und GlyT1(fl/fl) / Syn Cre Mäuse, welche einen glialen bzw. neuronalen knockout des GlyT1 aufweisen analysiert. Nach CCI Behandlung ergab sich bei GlyT1(fl/fl) / GFAP Cre Tieren eine Variabilität unter den Tieren bezüglich der Schmerzantwort nach mechanischer Stimulation. Durch eine immunhistologische Analyse des GlyT1 im Rückenmark konnte eine variable Expression des GlyT1 in diesen Tieren nachgewiesen werden. GlyT1(fl/fl) / Syn Cre Mäuse zeigten dagegen keine Unterschiede bezüglich der Schmerzantwort nach CCI oder Bitopertin Behandlung gegenüber WT Tieren. Nachfolgend müssten weiterführende Experimente mit größerer Tierzahl erfolgen. Bei der weiteren Analyse naiver GlyT1(fl/fl) / GFAP Cre Tiere zeigten diese eine Erhöhung der Glycinkonzentration im CSF, während die Konzentration im Blut verglichen mit WT Tieren nicht erhöht war. Durch die Behandlung mit dem irreversiblen GlyT1 Inhibitor ALX5407 an WT Mäusen konnte ebenfalls eine Erhöhung der Glycinkonzentration im CSF erzielt werden.The perception of pain allows the appropriate reaction of organisms to potentially noxious stimuli and¬ thus prevents them from damage. Chronic inflammation, systemic diseases or lesions of the peripheral or central nervous system can result in a pathologic nozizeptiv hyperactivity, called neuropathic pain. This include spontaneously and/or exaggerated pain responses to even mild stimuli (allodynia and hyperalgesia). The treatment of neuropathic pain is difficult and the therapeutic results are in many cases not satisfactory. It has been shown that dysfunction of spinal glycinergic neurotransmission is a major cause for the persistence of neuropathic pain. Glycine transporter 1 (GlyT1) plays an important role in regulating extracellular glycine concentrations and might thereby an approach to modulate glycinergic inhibition in pain signalling. Aim of the current study was to investigate if the specific, reversible GlyT1 inhibitor Bitopertin has beneficial effects in the single and long-term application in neuropathic and inflammatory pain model in mice. Neuropathic pain was induced by chronic constriction nerve injury (CCI) of the left sciatic nerve, inflammatory pain was induced by carrageenan injection into the plantar surface of the hind paw. Mechanical allodynia and thermal hyperalgesia were determined with a dynamic plantar aesthesiometer und hargreaves apparatus. General activity was determined in openfield experiments. The glycine concentration in cerebrospinal fluid (CSF) and blood was measured by HPLC. A single application of Bitopertin significantly ameliorated both, mechanical allodynia and thermal hyperalgesia in neuropathic and inflammatory pain model, without affecting acute pain. Longterm application by osmotic minipumps revealed that the antinozizeptive effects can be maintained over four weeks. Neither single nor longterm application had negative effects on motor coordination, general activity and/or anxiety behaviour. No negative effects were observed during single or longterm application of Bitopertin on naïve mice. Bitopertin significant increase the glycine concentration in the CSF without affecting the glycine concentration in the blood. Longterm application had no effect on the haemoglobin synthesis. Taken together, these findings suggest that modulation of the GlyT1 may be a useful therapeutic approach for the treatment of chronic pain states and for the further development of potential new drugs. Furthermore, the GlyT1 substrate N-Ethylglycine (NEG) was also investigate in neuropathic pain model. A single application of NEG significantly ameliorated mechanical allodynia. After NEG application in naïve mice no negative effects on motor coordination, general activity and/or anxiety behaviour were observed. In addition to wildtype mice conditional GlyT1(fl/fl) / GFAP Cre and GlyT1(fl/fl) / Syn Cre mice, which have a glial or neuronal knockout of the GlyT1, were analysed. After CCI treatment the GlyT1(fl/fl) / GFAP Cre mice showed a variability within the population regarding the pain threshold after mechanical stimulation. Immunhistological analysis of the GlyT1 in the spinal cord revealed a variable expression of the GlyT1 in these mice. In GlyT1(fl/fl) / Syn Cre mice no differences regarding the pain threshold after CCI or Bitopertin treatment compared to wildtype mice were observed. Additional experiments with a larger number of animals were subsequently necessary. Naïve GlyT1(fl/fl) / GFAP Cre mice showed an increase of the glycine concentration in the CSF whereas the glycine concentration in the blood compared to wildtype mice was not increased. The treatment with the irreversible GlyT1 inhibitor ALX5407 on wildtype mice also resulted in an increase of the glycine concentration in the CSF