Analysis of signal transduction chains of gravity and light sensing in Euglena gracilis

Der eukaryotische Süßwasserflagellat Euglena gracilis nutzt verschiedene Umweltreize wie gelöste Substanzen, Licht und Schwerkraft, um in der Wassersäule den optimalen Bereich für Photosynthese zu finden (durch Chemo-, Photo- und Gravitaxis). Die vorliegende Arbeit betrachtet die Mechanismen der Gravi- und Lichtwahrnehmung in E. gracilis. Durch Silencing mittels RNAi wurden bereits zuvor Bestandteile der beteiligten Signaltransduktionsketten identifiziert: die photoaktivierte Adenylatzyklase (photoactivated adenylyl cyclase, PAC) im Paraxonemalkörper kontrolliert die Phototaxis, ein Calmodulin 2 (CaM2) die Gravitaxis und eine Proteinkinase A (PKA) beide. Im Folgenden wird gezeigt, dass PKA hauptsächlich in der Ampulle lokalisiert ist, während CaM2 in der gesamten Zelle vorkommt. Außerdem wurden mit Hilfe von Studienreihen mit dem Hefe-Zwei-Hybrid-System potentielle Interaktionspartner dieser beiden Proteine ermittelt. Der Knock-down von EgPCDUF4201, einem mutmaßlichen Interaktionspartner von CaM2, führt zu einer verminderten Gravitaxis. Die Lokalisation der PKA und ihre Beteiligung an der Phototaxis deutet auf eine Verbindung zur PAC hin, was in der vorliegenden Arbeit durch Untersuchungen des Expressionslevel der PAC in PKA-Knock-down-Mutanten bestätigt werden konnte. Darüber hinaus wurden physiologische Parameter wie Schwimmgeschwindigkeit, Zellform, Beweglichkeit, Anteil der aufwärts schwimmenden Zellen, r-Wert und photosynthetische Pigmente zusammen mit den Expressionslevels von CaM2 und PKA in einer wachsenden E. gracilis-Kultur untersucht. Alle Parameter variierten über die exponentielle und stationäre Phase des Kulturwachstums mit Ausnahme der Beweglichkeit. Während die Transkription von PKA und CaM2 über die Kulturdauer tendenziell abnahm, nahm die Proteinsynthese von PKA zu; die von CaM2 blieb gleich. Ein Experiment in der unbemannten chinesischen Raumkapsel Shenzou 8 diente dazu, mehr über das Expressionsprofil ausgewählter Gene von E. gracilis zu erfahren. 32 Gene aus verschiedenen funktionalen Bereichen (Signaltransduktion, Abwehr von oxidativem Stress, Zellzyklusregulation und Hitzeschockantwort) wurden untersucht. 18 wurden hochreguliert, eines wurde herunterreguliert, der Rest blieb auf einem vergleichbaren Niveau, was darauf hindeutet, dass Mikrogravitation in E. gracilis Stress auslöst.Euglena gracilis is a eukaryotic fresh water flagellate, which uses various stimuli (chemicals, light and gravity) to reach an optimal niche for photosynthesis in a water column. The current thesis focuses on two pronounced mechanisms of E. gracilis: gravity and light sensing. Previously, members of the signal transduction chains of these two mechanisms have been identified by gene silencing studies through RNAi: The photoreceptor, photoactivated adenylyl cyclase (PAC) is enriched in the paraflagellar body which controls phototaxis, a calmodulin 2 (CaM2) which controls gravitaxis, and a protein kinase A (PKA) which controls both. In this study, PKA was shown to be localized mainly in the reservoir region, while CaM2 is present in the cell body. Furthermore, yeast two hybrid screens allowed the identification of potential interaction partners of these two proteins. Knocking down one of the CaM2 putative interaction partners, EgPCDUF4201, leads to an impaired gravitaxis. The localization of PKA and its involvement in phototaxis suggested a potential link with PAC which has been confirmed in this report by studying the expression level of PAC in PKA knock down mutants. Additionally, some physiological parameters (swimming velocity, cell shape, motility, upward swimming of cells, r-value, and photosynthetic pigments) were analyzed in a growing culture of E. gracilis, as well as the expression level of CaM2 and PKA. Whereas the cellular motility remains stable, the other parameters varied in exponential and stationary phase. A descending trend was observed in the transcription levels of the PKA and CaM2 whereas the protein expression levels of the PKA showed an ascending trend (from exponential phase to late stationary phase) and the protein expression levels of the CaM2 remained unaffected. Furthermore, a study was conducted on the unmanned Chinese space craft Shenzou 8 to understand the expression profile of selected genes of E. gracilis. 32 selected genes from different functional groups (signal transduction, oxidative stress defense, cell cycle regulation and heat shock responses) were analysed; 18 were up-regulated, one down-regulated and the rest remained unaltered, indicating that microgravity exposure induced stress in E. gracilis