Evaluation of nutritive modulators of the free fatty acid receptor 1 (FFAR1)

In der vorliegenden Arbeit wurden nutritive Modulatoren des Freie Fettsäurerezep-tors 1 (FFAR1) evaluiert. FFAR1 ist ein G-Protein gekoppelter Rezeptor (GPCR) dessen endogene Liganden mittel- und langkettige gesättigte und ein- beziehungsweise mehr-fach ungesättigte freie Fettsäuren sind und der im menschlichen Körper in zahlreichen Geweben in der Peripherie wie dem Pankreas, dem Magen oder dem Darm exprimiert wird. Der FFAR1 spielt dabei eine wichtige Rolle in der Regulation des Blutzuckerspie-gels. Über eine Aktivierung des Rezeptors mit Fettsäuren wird die glucose-induzierte Insulinsekretion potenziert und so die Blutzuckerkonzentration nach einer Mahlzeit wieder auf physiologisches Niveau herabgesenkt. Diese biologische Funktion macht den FFAR1 zu einem potenten Ziel für die Behandlung von Typ 2 Diabetes Mellitus. Eine weitere wichtige Funktion spielt der FFAR1 in der Regulation der Energiehomöo-stase. Zahlreiche enteroendokrine Zellen, welche anorexigene Sättigungshormone, wie Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1) und Cholecystokinin (CCK), sekretieren exprimieren ebenfalls den FFAR1. Erwiesenermaßen wurde dabei bereits ein direkter Einfluss von freien Fettsäuren auf die verstärkter Freisetzung von Sättigungssignalen beobachtet. Somit hat eine Aktivierung des FFAR1 unmittelbare Auswirkungen auf die Energieauf-nahme und damit letztendlich auch auf das Einsetzen eines Sättigungsgefühls. Rezep-toren wie FFAR1, deren endogene Liganden Makronährstoffe wie freie Fettsäuren sind, und die über ihre Aktivierung und nachgeschaltete Signaltransduktion unter anderem die Freisetzung von Sättigungssignalen anstoßen, sind in der Lage nutritives Chemo-sensing zu betreiben und spielen eine wichtige Rolle in den hoch komplexen Mecha-nismen der Appetitregulation. Im Hinblick auf die weltweit rasant anwachsende Popu-lation adipöser Menschen ist es von besonderem Interesse ein fundamentales Ver-ständnis über das Regulationswerk der Energiehomöostase und die direkte Wirkung diverser Nährstoffe auf den Metabolismus zu erlangen. Im Rahmen dieser Arbeit sollte deshalb zunächst eine Methode zur Messung der direkten Aktivierung von FFAR1 mit-tels Änderungen in der intrazellulären Calciumkonzentration in Zellexperimenten etabliert, umfassend optimiert und validiert werden. Zur Validierung der Methode wur-den Dosis-Wirkungskurven ausgewählter Fettsäuren erstellt und die ermittelten EC50-Werte mit Literaturdaten abgeglichen. Die Experimente, die im zweiten Teil der Dissertation durchgeführt wurden, lieferten genauere Einblicke in die Struktur-Aktivitätsbeziehung zwischen FFAR1 und seinen natürlichen Liganden. Wir konnten zeigen, dass die Länge der Kohlenstoffkette einen großen Einfluss auf das Aktivierungspotential freier Fettsäuren am FFAR1 hat. Gesät-tigte kurzkettige Fettsäuren besitzen ab einer Kettenlänge von sechs Kohlenstoffato-men stimulatorische Aktivität am FFAR1, welche sich mit wachsender Kettenlänge bis zur mittelkettigen Caprinsäure weiter steigert. Langkettige gesättigte Fettsäuren wie Stearinsäure bewirken jedoch eine deutlich reduzierte Calciumfreisetzung am FFAR1. Die mittelkettigen Fettsäuren erwiesen sich als die potentesten Stimulatoren inner-halb der untersuchten gesättigten Fettsäuren (C4:0 C16:0 > C18:0). Auch bei den einfach ungesättigten Pendants der untersuchten mittel- bis langkettigen Fettsäuren nahm die Fähigkeit Calcium aus intrazellulären Speichern zu mobilisieren mit steigender Kohlenstoffkette ebenfalls ab (C11:1 > C16:1 > C18:1), wobei der Verlust des stimulatorischen Potentials nicht so stark ausgeprägt war wie für die gesättigten Fettsäuren. Bezüglich des Einflusses, den die Anzahl an Doppelbindungen innerhalb eines Fettsäu-remoleküls auf die Rezeptoraktivierung hat, konnten wir zeigen, dass sich eine zuneh-mende Anzahl an Doppelbindungen bei gleichbleibender Kettenlänge positiv auf das Aktivierungspotential am FFAR1 auswirkte (C18:1 C22.6). Der maximale Effekt konnte für die vierfach ungesättigte Arachidonsäure gefunden werden. Des Weiteren konnte beobachtet werden, dass auch die Position an der sich die Dop-pelbindung in einer ungesättigten Fettsäure befindet auf das stimulatorische Potential am FFAR1 auswirkte. Dabei erwies sich eine kurze Distanz zwischen der Carboxylgrup-pe der Fettsäure und ihrer ersten Doppelbindung als förderlich für das Aktivierungspo-tential. Während der Lebensmittelprozessierung sind Fette oftmals hohen Temperaturen aus-gesetzt. Unter diesen Bedingungen sind ungesättigte Fettsäuren chemisch instabil und anfällig für Oxidation, Isomerisierung und Polymerisierung. Unter diesen Bedingungen können dabei aus den natürlicherweise cis-konfigurierten Fettsäuren ihre trans Isomere entstehen. Eine weitere Aufnahmequelle von trans-Fettsäuren ist der Verzehr von Milchprodukten und Fleischerzeugnissen von Wiederkäuern. Der Konsum dieser trans-Fettsäuren wird mit einem erhöhten Risiko an Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu erkran-ken in Verbindung gebracht und soll deshalb aus ernährungsphysiologischer Sicht mög-lichst vermieden werden. Wir konnten zeigen, dass die trans-Isomere der Fettsäuren die biologische Funktionalität deutlich beeinflussten und alle hier untersuchten trans-Isomere im Vergleich zu den entsprechenden cis-Isomeren ein signifikant geringeres Aktivierungspotential am FFAR1 besaßen. Den größten Aktivitätsverlust im Vergleich zum cis-Isomer konnten wir für die trans-Vaccensäure finden, welche beispielsweise in Frittierfett die Hauptfraktion an trans-Fettsäuren ausmacht. Ferner wurde der Einfluss von substituierten Linolsäuren auf den FFAR1 untersucht. Dabei konnten wir zeigen, dass sich die Einführung einer Hydroxyfunktion in Position 9 beziehungsweise Position 13 nicht aber einer Hydroperoxyfunktion in Position 13 posi-tiv auf die Aktivierung am FFAR1 auswirkte. Dabei spielte es hinsichtlich des Aktivie-rungspotentials am FFAR1 eine Rolle an welcher Position sich die Hydroxygruppe im Fettsäuremolekül befand. Eine Hydroxy Substitution der Linolsäure in Position 13 re-sultierte in der stärksten Calciumfreisetzung. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden in einem Modellversuch Koch- und Frittierbedin-gungen (40 °C, 99 °C und 180 °C) simuliert und die Auswirkung der Hitzeeinwirkung auf das Aktivierungspotential der Linolsäure in Abhängigkeit von der Erhitzungszeit sowie der Anwesenheit von Sauerstoff untersucht. Wir konnten zeigen, dass alle erhitzten freien Fettsäuren mit zunehmender Erhitzungsdauer eine erhöhte stimulatorische Ak-tivität am FFAR1 hatten. Ein direkter Vergleich der jeweils für 24 h erhitzten Fettsäu-ren ergab, dass dieser Effekt unabhängig von der für die Wärmebehandlung gewählten Temperatur war. Des Weiteren konnten wir feststellen, dass die unter Abwesenheit von Sauerstoff erhitzten Proben nahezu denselben Verlauf in den Calciummessungen her-vorriefen, wie die unter Umgebungsatmosphäre erhitzten Fettsäuren und auch hier die Calciumfreisetzung mit zunehmender Erhitzungsdauer verstärkt wurde. In den erhitz-ten Fettsäuren wurde anschließend sowohl der totale Lipidhydroperoxidgehalt als auch eine Quantifizierung von 9 Hydroperoxylinolsäure (9-HpODE) und 13 Hydroperoxylinolsäure (13-HpODE) vorgenommen. Wir konnten feststellen, dass die Bildung von Lipidhydroperoxiden in starker Abhängigkeit von der Temperatur der Wärmebehandlung steht. Die unter Umgebungsatmosphäre auf 40 °C erwärmten Pro-ben zeigten mit zunehmender Erhitzungsdauer eine starke Zunahme im Lipidhydroper-oxidgehalt wohingegen die auf 99 °C erhitzten Pendants lediglich zu Beginn der Hitze-einwirkung gesteigerte Konzentrationen an Hydroperoxofettsäuren enthielten. Ver-mutlich reagieren die Hydroperoxide bei hohen Temperaturen schnell zu Sekundärpro-dukten weiter. In allen unter Sauerstoffausschluss erhitzten Proben waren nur geringe Mengen an Lipidhydroperoxiden zu finden. Durch die in diesen Experimenten gefunde-nen Ergebnisse lässt sich schlussfolgern, dass eine Hydroperoxomodifikation der Fett-säure vermutlich nicht für das gesteigerte Aktivierungspotential erhitzter Fettsäuren am FFAR1 verantwortlich ist. Die starken Variationen im Lipidhydroperoxidgehalt in den einzelnen Proben und der sehr ähnliche Effekt im Hinblick auf die Fähigkeit der erhitzten Proben Calcium über Stimulation des FFAR1 freizusetzen stehen in Wider-spruch zueinander. Um eine Idee davon zu bekommen, wie sich Hitzeeinwirkung auf die chemische Zu-sammensetzung von Linolsäure auswirkt wurden im Folgenden Hochleistungsflüs-sigchromatographie mit kombinierter Diodenarray und massenspektrometrischer De-tektion durchgeführt. Durch diese Untersuchungen stellte sich heraus, dass sich mit zunehmender Erhitzungsdauer die chemische Zusammensetzung der Proben stark än-derte und neben den Hydroperoxiden noch weitere Reaktionsprodukte entstanden wa-ren. Des Weiteren existierten nach einer Wärmebehandlung von 99 °C weitere Reakti-onsprodukte, welche bei 40 °C nicht vorhanden waren. Die hiergefundenen Ergebnisse machen deutlich, dass eine Wärmebehandlung durch-aus physiologische Konsequenzen zur Folge haben kann. So konnte gezeigt werden, dass erwärmte Linolsäure mit zunehmender Dauer der Hitzeeinwirkung eine gesteiger-te agonistische Aktivität am FFAR1 besaß und dadurch eine verstärkte Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern bewirkte. Gemeinsam mit den Ergebnissen, wel-che durch die Untersuchungen der Struktur-Aktivitätsbeziehung erhalten wurden, konnten durch die Modellversuche wichtige Erkenntnisse auf die biologische Funktio-nalität des FFAR1 gewonnen werden und potente nutritive Modulatoren für den FFAR1 ausgemacht werden. Über nutritives Chemosensing von Fettsäuren und die gezielte Aufnahme hochwirksamer Stimulatoren des FFAR1, sollte eine Beeinflussung des kom-plexen Mechanismus der Appetitregulation möglich sein. Durch die erhöhte Aktivität des FFAR1 und eine damit möglicherweise einhergehende vermehrte Ausschüttung von Sättigungshormonen würde es zu einem schneller einsetzenden Sättigungsgefühl kommen und damit die Energieaufnahme während einer Mahlzeit vermindert werden.Nutritive modulators of the free fatty acid receptor 1 (FFAR1) were evaluated in the presented work. The FFAR1 is a G-protein coupled receptor (GPCR) whose endogenous ligands are medium- to long-chain saturated and mono- or, respectively, polyunsatu-rated free fatty acids. The FFAR1 is ubiquitously expressed in numerous peripheral tis-sues of the human body such as pancreas, stomach or intestine and is prominently in-volved in the regulation of the blood glucose level. Receptor activation with fatty acids potentiates glucose-induced insulin secretion and therefore reduces blood glucose con-centrations after meal intake to physiological levels. Due to this biological function the FFAR1 is a potent target for treatment of type 2 diabetes mellitus. The FFAR1 also plays an important role in the regulation of energy homeostasis. A plethora of entero-endocrine cells, which secrete anorexigenic satiety signals as glucagon like peptide 1 (GLP 1) and cholecystokinin (CCK), also express FFAR1. Evidentially, direct influence of free fatty acids on enhanced release of satiety signals has already been observed. Thus, activation of FFAR1 has direct effects on energy intake and ultimately also on the onset of the feeling of satiety. Receptors such as FFAR1, whose endogenous ligands are mac-ronutrients like free fatty acids and which are able to induce release of satiety signals by being activated, and their subsequent signal transduction, are capable of nutrient chemosensing and play a pivotal role in the highly complex mechanism of appetite regulation. Regarding the rapid increase in worldwide obese population, it is therefore of tremendous interest to gain a fundamental understanding of the regulation of ener-gy homeostasis and it is essential to clarify the direct effects of diverse nutrients on human metabolism. Therefore, a method for measurement of the direct activation of FFAR1 was to be established, comprehensively optimized and validated in the first part of the work. For method validation, dose-response-curves of selected fatty acids were recorded, and determined EC50-values were compared to literature data. Experiments that were conducted in the second part of the thesis provided detailed insights into the structure-activity relationship of receptor and endogenous ligands. We were able to demonstrate a great impact of chain length on the potential of free fatty acids to activate FFAR1. Short-chain saturated fatty acids with at least six carbon atoms showed potential to activate FFAR1, with an even increasing potency with grow-ing chain length up to capric acid. Long-chain saturated fatty acids, such as stearic ac-id, provoked a considerably reduced calcium release. Mid-chain fatty acids proved to most potently activate FFAR1 within examined saturated fatty acids (C4:0 C16:0 > C18:0). This was also true for monounsaturated equivalents of examined mid- to long-chain fatty acids. The ability to release calcium from intracellu-lar stores decreased with increasing carbon chain length, whereby loss of stimulatory potency was less pronounced as with saturated fatty acids. Regarding the influence of number of double bonds within a fatty acid molecule on re-ceptor activation, we could demonstrate that, given the same length of the carbon chain, an increasing number of double bonds has positive effects on the induction of calcium release (C18:1 C22:6). The maximum effect was pro-voked by fourfold unsaturated arachidonic acid. Furthermore, we could also observe that the position of the double bond within an unsaturated fatty acid molecule has an impact on the potency of FFAR1 stimulation to the effect that a short distance between the carboxylic moiety of the fatty acid and the first double bond has beneficial effects on activation. During food processing fats are often exposed to high temperatures. Given these condi-tions, unsaturated fatty acids are chemically instable and prone to oxidation, isomeri-zation and polymerization reactions. Furthermore, naturally occurring cis fatty acids can be transformed into their corresponding trans isomers. Another dietary source of trans fatty acids is the intake of dairy and meat products from ruminant animals. Con-sumption of trans fatty acids is associated with a higher risk of cardiovascular disease and intake of these fatty acids should be prevented from a nutrition-physiological point of view. We were able to demonstrate that fatty acid trans isomers prominently influence biological activity of FFAR1 and that all examined trans fatty acids showed a significantly reduced potency to release calcium compared to corresponding cis isomers. Compared to its cis isomer major loss regarding stimulation potency was found for trans vaccenic acid, which for example represents the main fraction of trans-fatty acids in deep-frying fat. Moreover we examined the influence of substitution of linoleic acid with respect to FFAR1 activation. We found that substitution of linoleic acid with a hydroxyl function-ality in position 9 or position 13, respectively, but not with a hydroperoxyl moiety in position 13 has positive effects on calcium release. Regarding potency of receptor acti-vation it is important in which position the substitution took place. Thereby insertion of a hydroxyl moiety in position 13 resulted in strongest calcium release. In the third part of this work cooking and deep-frying conditions were simulated in model experiments (40 °C, 99 °C and 180 °C) and the impact of heat exposure on linole-ic acid’s potency on receptor activation was examined depending on heating period and presence of atmospheric oxygen. We demonstrated that all heated free fatty acids pro-voked a stronger calcium release with longer heating time. Head-to-head comparison of samples that were each heated for 24 h at different temperatures revealed that this effect was independent of the heating temperature. Furthermore we found that sam-ples that were heat-treated in the absence of atmospheric oxygen caused an almost similar effect as compared to samples that were heated under surrounding atmosphere and also provoked a stronger calcium release with increasing heating time. Subse-quently the overall content of lipid hydroperoxides as well as 9-hydroperoxy-10E,12Z-octadecadienoic acid (9-HpODE) and 13 hydroperoxy-10E,12Z-octadecadienoic acid (13-HpODE) was quantified in heated fatty acids. We found a strong dependence of lipid hydroperoxid generation and temperature of heating. Samples that were heated in sur-rounding atmosphere to 40 °C showed a strong increase in lipid hydroperoxid content with increasing heating time whereas samples that were heated at 99 °C only showed high concentrations of lipid hydroperoxides at the beginning of the heating period. Presumably highly reactive hydroperoxides rapidly form secondary oxidation products at high temperatures. In all samples that were heated in the absence of atmospheric oxygen only a minor concentration of lipid hydroperoxides was to be found. Therefore we concluded that hydroperoxy modifications are not responsible for the increased cal-cium release provoked by heated fatty acids. Strong variations in total lipid hydroper-oxide content dependent on temperature of heating are inconsistent with similar ef-fects regarding calcium release provoked by heated samples at all temperatures exam-ined. To gain an idea of how heat treatment influences the chemical composition of linoleic acid we performed measurements using high-performance liquid chromatography cou-pled with diode array detector and mass spectrometry (HPLC-DAD-MS). These experi-ments showed that the chemical composition of the heat treated samples varied prom-inently with increasing heating time and that further reaction products other than hy-droperoxides occurred. Furthermore, comparing samples heat treated at 99 °C and at 40 °C, respectively, we found additive reaction products that could not be detected in linoleic acid heated to 40 °C. Taken together, these results indicate that heat treatment of free fatty acids presuma-bly will result in physiological consequences. Thus it could be shown that heated lino-leic acid with increasing heating time provoked an enhanced calcium release from in-tracellular stores by activation of FFAR1. Together with the results gained from exper-iments regarding the structure-activity relationship prominent, insights regarding the biological functionality of FFAR1 as well as on potent nutritive modulators of FFAR1 could be obtained. Therefore it should be possible to influence the complex mechanism of appetite regulation taking advantage of nutritive chemosensing of fatty acids and focused intake of highly potent stimulators of FFAR1. Hypothetically, an earlier onset of the feeling of satiety could be provoked by enhanced activity of fatty acids that would than presumably result in a stronger release of satiety signals, which in turn would result in a diminished energy intake during a meal