Funktionelle Charakterisierung von Vav1 in primären Makrophagen im experimentellen Entzündungsmodell der Sepsis

Sepsis ist gemäß den Richtlinien des American College of Chest Physicians (ACCP) und der Society of Critical Care Medicine (SCCM) eine systemische Abwehrreaktion des Organismus auf eine bakterielle, fungide oder Einzeller-vermittelte Infektion (Bone et al. 1992; Levy et al. 2003). Sepsis ist eine dynamisch verlaufende, systemisch exzessive Reaktion des Organismus. Sepsis kann ohne medizinische Intervention zum septischen Schock, multiplem Organversagen und letztlich zum Tod führen (Bone et al. 1992; Levy et al. 2003). Proinflammatorische Zytokine wie IL-6 und TNF-α werden u. a. während der hyperinflammatorischen Immunreaktionen der Sepsis exzessiv von Zellen des angeborenen Immunsystems wie Makrophagen und neutrophilen Granulozyten sezerniert (Hotchkiss und Karl 2003; Riedemann et al. 2003a). Das proinflammatorische Zytokin IL-6 wird als ein Prognose- und Risikomarker für Sepsispatienten herangezogen. Erhöhte Konzentrationen an IL-6 im Blut korrelieren mit der Mortalitätsrate von Sepsispatienten (Damas et al. 1992; Hack et al. 1989; Pallua et al. 2003). Die hier dargestellten Untersuchungen in akuten experimentellen Entzündungsmodellen der Sepsis und folglich in der in vivo und ex vivo LPS-induzierten Endotoxinämie zeigten eine neue in vivo Relevanz des Vav1-Proteins. Erstmals konnten wir in primären Makrophagen nachweisen, dass Vav1 eine inhibierende Wirkung auf die Sekretion des proinflammatorischen Zytokins IL-6 besitzt (Zenker et al. 2014). Die protektive in vivo Wirkung von Vav1 äußerte sich in der LPS-induzierten Endotoxinämie durch eine signifikant erniedrigte Überlebensrate von Vav1-/-- gegenüber Wildtyp (WT)-Mäusen. Die Vav1-/--Mäuse wiesen eine signifikant erhöhte Konzentration an IL-6 und gleichzeitig erhöhte Konzentrationen an weiteren entzündungsassoziierten Parametern wie Kreatinin, GLDH und AST sowie Nitrit in den ersten Stunden der LPS-induzierten Endotoxinämie auf. Auf zellulärer Ebene ergaben durchflusszytometrische Analysen des Blutes und der Peritoneallavage von WT- und Vav1-/--Mäusen, dass aktivierte Vav1-/--Makrophagen eine erhöhte IL-6 Sekretion aufwiesen. Die Vav1 Defizienz hatte keinen Einfluss auf die Anzahl der in vivo nachgewiesenen Makrophagen. Die Bedeutung des proinflammatorischen Zytokins IL-6 für die signifikant erhöhte Mortalitätsrate in Vav1-/--Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen in der hier durchgeführten LPS-induzierten Endotoxinämie konnte durch eine Behandlung mit anti-IL-6R Antikörper (MR16-1) belegt werden. Die Antikörper-vermittelte Neutralisation des IL-6-Rezeptor-Signalweges (Barkhausen et al. 2011; Okazaki et al. 2002) resultierte daraus, dass sich die Überlebensrate von Vav1-/--Mäusen nach LPS Exposition auf WT-Niveau anglich. Ergänzend hierzu belegte die LPS-induzierte Endotoxinämie in RAG2 defizienten Mäusen, dass auch hier die Deletion des Vav1 zu einer erhöhten Mortalitätsrate im Vergleich zu RAG2-/-Vav1+/+-WT-Mäusen führt. Dieses in vivo Ergebnis bewies, dass die Hypersensitivität Vav1-/--Mäuse in der LPS-induzierten Endotoxinämie auch unabhängig vom adaptiven Immunsystem bestehen blieb. Zugleich unterstrichen in vivo erhobene Ergebnisse in Makrophagen-depletierten WT-Mäusen, dass Vav1 seinen protektiven Effekt bei der LPS-induzierten Endotoxinämie besonders über Makrophagen vermittelt. Die LPS-induzierte Endotoxinämie führte in Makrophagen-depletierten, mit Vav1-/--Peritonealmakrophagen rekonstituierten WT-Mäusen zu einer signifikant erhöhten Mortalitätsrate gegenüber den mit WT-Peritonealmakrophagen rekonstituierten Mäusen. Vav1 hat somit einen entscheidenden Einfluss auf die Funktion der Makrophagen und deren IL-6 Expression. Es reduziert infolgedessen die Mortalität im experimentellen Modell der LPS-induzierten Endotoxinämie. Die beschriebene protektive in vivo Wirkung des Vav1-Proteins auf die LPS-induzierte IL-6 Expression konnte in in vitro kultivierten primären Peritonealmakrophagen bestätigt und genauer analysiert werden. Vav1 supprimiert in Thioglykolat angereicherten Peritonealmakrophagen sowohl die Transkription als auch die Translation des IL-6 Gens. In vitro konnte die signifikant erhöhte IL-6 Sekretion nicht auf eine gesteigerte TLR4 Expression zurückgeführt werden. Ebenso wurden die klassischen IL-6 Regulatoren, wie NFκB oder SOCS-Proteine, nicht signifikant vermehrt in Vav1-/--Peritonealmakrophagen aktiviert bzw. exprimiert. Ein weiterer Transkriptionsfaktor, der regulierend auf die IL-6 Sekretion einwirkt, ist der sogenannte Hitze-Schock-Faktor (heat shock factor, HSF) 1. Die HSF1-Bindung am IL-6 Promoter initiiert eine Öffnung der Chromatinstruktur, die anschließend eine Rekrutierung weiterer Transkriptionsfaktoren begünstigt. Die HSF1-vermittelte Öffnung der Chromatinstruktur ermöglicht eine maximale LPS-induzierte Expression von IL-6 (Inouye et al. 2007). Mittels Immunopräzipitation und konfokaler Immunofluoreszenzfärbung wurde in dieser Arbeit erstmalig gezeigt, dass Vav1 mit HSF1 interagiert. Die Doppel-Fluoreszenzfärbung belegte zusätzlich, dass sowohl Vav1 als auch HSF1 sich nach LPS-Exposition unmittelbar in der Nähe des Zellkernes oder im Zellkern befinden. Weiterhin konnte anhand von Ergebnissen, die mit Hilfe der Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) und des µMACS FactorFinder Kit erhoben wurden, gezeigt werden, dass nur unter LPS-Stimulation Vav1 an die spezifische HSF1 Bindungsstelle des IL-6 Promoters assoziierte. In primären Peritonealmakrophagen konnte somit eine erhöhte Bindungsaffinität von Vav1 zu HSF1 nach LPS-Stimulation an einer optimalen kanonischen HSF1-Bindungssequenz im IL-6 Promoter belegt werden. Die funktionelle Relevanz des Vav1 für die LPS-induzierte HSF1-vermittelte IL-6 Sekretion wurde mittels Luciferase-Promoterstudien belegt. Hierfür wurden entweder WT IL-6 Promoterkonstrukte oder Konstrukte mit Deletionsformen der HSF1-Bindungssequenz im HSE2 Fragment des IL-6 Promoter verwendet. Erwartungsgemäß bedingte eine Abwesenheit von Vav1 eine signifikant erhöhte Aktivität des WT IL-6 Promoters. Dieser Unterschied in der Promoteraktivität zwischen WT- und Vav1-/--Makrophagen konnte allerdings nicht mehr beobachtet werden, wenn eine Deletionsform der HSF1-Bindungssequenz im HSF2 Fragment des IL-6 Promoterkonstruktes verwendet wurde. Es konnte somit erstmalig gezeigt werden, dass Vav1 auf transkriptioneller Ebene die HSF1-vermittelte IL-6 Transkription supprimiert. Diese in vitro Daten belegen den in vivo beobachteten regulierenden Effekt von Vav1 auf die IL-6 Sekretion in primären Makrophagen.The American College of Chest Physicians (ACCP) and the Society of Critical Care Medicine (SCCM) defined sepsis as a Systemic Inflammatory Response Syndrome (SIRS) of the organism to a bacterial, fungoid or monad mediated infection (Bone et al. 1992; Levy et al. 2003). The SIRS is characterized by cytokine storm of proinflammatory mediators like IL-6, TNF-α secreted e.g. by macrophages (Hotchkiss and Karl 2003; Riedemann et al. 2003a). Sepsis without medical intervention can lead to a septic shock, multiple organ failure and finally to death (Bone et al. 1992). The proinflammatory cytokine IL-6 is used as a prediction and risk marker for sepsis patients. A pathological overproduction of IL-6 was demonstrated in sepsis patients and was associated with an increased mortality rate (Damas et al. 1992; Hack et al. 1989; Pallua et al. 2003). In this study, we took advantage of acute experimental inflammation models of sepsis. Results from in vivo and ex vivo performed experiments indicated a new in vivo relevance of the Vav1 protein in the context of sepsis. This study identified an unexpected protective function of Vav1 and its capacity to suppress LPS-induced IL-6 gene transcription in primary macrophages (Zenker et al. 2014). A significant reduced survival rate of Vav1-/- mice compared to wild type (WT) mice indicated a protective in vivo impact of Vav1 on acute sepsis inflammation. Vav1-/- mice showed a significant increased concentration of IL-6 and of additional inflammation-associated parameters like creatinine, glutamate dehydrogenase (GLDH), aspartate aminotransferase (AST) as well as nitrite during the first hours of LPS endotoxemia. Furthermore, flow cytometry analysis of blood and peritoneal lavage demonstrated that the significant increased concentration of IL-6 in Vav1-/- mice resulted from an increased IL-6 expression per single activated macrophage. The Vav1 deficiency had no influence in the overall percentage of macrophages within blood or peritoneal cells. The functional relevance of IL-6 for the significant increased mortality rate of Vav1-/- mice could be proven by systematic treatment with anti-IL-6R antibody. Neutralization of IL-6-receptor-signal transduction pathway (Barkhausen et al. 2011; Okazaki et al. 2002) resulted in decreased severity of disease and increased survival rates in Vav1-/- mice compared to WT mice. To exclude the possibility that the reduced number of lymphocytes in Vav1-/- mice might play a role in the observed significant increased mortality rate of Vav1-/- mice, Vav1-deficient and -proficient RAG2-/- mice were subjected to LPS treatment. Indeed, even in the absence of B and T lymphocytes and NKT cells in RAG2-/- mice, deletion of Vav1 lead to an increased mortality rate of RAG2-/-Vav1-/-- compared to RAG2-/-Vav1+/+-WT mice, suggesting a predominant role for Vav1-deficiency in innate immune cells. To underline the role of Vav1 in activated macrophages, macrophage-depleted WT mice were reconstituted with WT or Vav1-/- peritoneal macrophages before LPS exposure. The reconstitution with Vav1-/- peritoneal macrophages led to a significantly higher mortality rate to LPS endotoxemia compared to mice reconstituted with WT macrophages. Therefore Vav1 has an important influence on the function of macrophages and macrophage derived IL-6 secretion. The described protective in vivo effect of Vav1-protein on LPS-induced IL-6 expression of macrophages could be confirmed in primary peritoneal macrophages and was afterwards analyzed more in detail. In thioglycollate-enriched peritoneal macrophages Vav1 deficiency resulted in increased transcription as well as the translation of IL-6 gene in response to LPS stimulation, whereas the absence of Vav1 did not affect the expression of TNF-α. The significantly increased IL-6 release was not based on an increased TLR-4 expression in Vav1-/- peritoneal macrophages. Similarly, the classic IL-6 regulators like NFκB or SOCS proteins did not show significantly up regulated expression or activation in LPS activated Vav1-/- peritoneal macrophages. Another transcription factor is essential for the IL-6 secretion: heat shock factor (HSF) 1. HSF1 binds to the IL-6 promoter and initiates an opening of the chromatin structure which is required for the recruitment of additional transcription factors as well as the maximum LPS induced expression of IL-6 (Inouye et al. 2007). By immune precipitation and confocal immune fluorescence staining we were able to show that Vav1 formed a complex with HSF1, suggesting an interaction between both proteins. In addition Vav1 and HSF1 were located in the nucleus of LPS stimulated macrophages. Furthermore, Chromatin immunoprecipitation (CHIP) analysis revealed a close association between Vav1 and the HSF1 binding site of the IL-6 promoter (HSE2 region) in stimulated WT macrophages. To confirm the capacity of Vav1 to associate with HSE2-bound HSF1 we used the µMACS FactorFinder Kit. After LPS stimulation, association of Vav1 with HSF1 in the optimal canonical HSF1-binding sequence in the IL-6 promoter could be identified. To underline the functional relevance of Vav1 in the LPS-induced HSF1-mediated IL-6 expression, luciferase reporter assays were performed, using either WT IL-6 promoter constructs or deletion constructs, which lack the HSE2 binding site (ΔHSE2) of the IL-6 promoter. While WT IL-6 promoter activity was significantly increased in the absence of Vav1, a lack of the HSE2 binding site completely abrogated differences observed between WT and Vav1-/- peritoneal macrophages. In summary, the interaction between Vav1, HSF1 and the HSE2 binding site of the IL-6 promoter resulted in the observed suppressive effect of Vav1 on LPS-induced IL-6 gene transcription in primary macrophages. To our knowledge, this is the first time that the involvement of Vav1 in DNA-binding complexes could be linked to a particular in vivo consequence. Such modulation of Vav1/ IL-6 linked inflammatory signaling during sepsis could be considered as a potential therapeutic strategy to improve survival of sepsis patients