Funktionsanalyse der Proteinkinase pUL97 des humanen Cytomegalovirus hinsichtlich der Ausprägung von drei verschiedenen Isoformen

The protein kinase pUL97 has been subject of intense research for more than twenty years, elucidating its role in phosphorylation of the antiviral drug ganciclovir and its multifunctional importance for the replication of human cytomegalovirus (HCMV). pUL97 predominantly accumulates in the nucleus of the host cell to exert influence on very basic steps of viral replication, like DNA synthesis, gene expression and nuclear capsid egress. However, the exact mechanism of nuclear translocation was poorly determined and many biochemical as well as functional characteristics of pUL97 remained to be investigated in more detail. The present study demonstrates for the first time that pUL97 is expressed in three distinct isoforms during HCMV infection with laboratory-adapted and naturally occurring strains. Using a series of plasmid-based expression constructs as well as recombinant HCMVs, the mode of isoform formation was specified as alternative initiation of translation at the in-frame ATG start codons M1, M74 and M157, respectively. Sequence alignments revealed an overall conservation and restriction of these start codons for human cytomegaloviruses. As an important finding, immunofluorescence analyses verified the positions of two candidate nuclear localization signals (NLS) within the mostly unstructured N-terminus at amino acids 6-35 (NLS1) and 190-213 (NLS2). Both NLS sequences were classified as bipartite motifs, highly conserved among HCMV strains and capable to interact with the adaptor molecule importin α. Moreover, NLS deletion mutants were used to identify the relevance of NLS1 and NLS2 for efficient translocation of pUL97 into the nucleus. Only minor effects were detectable after deletion of a single NLS sequence, but simultaneous deletion of NLS1 and NLS2 caused a strongly reduced nuclear import of pUL97 and a severe replication defect of HCMV. Interestingly, the N-terminally truncated isoforms M74 and M157, per se lacking NLS1, were characterized with incomplete nuclear translocation compared to isoform M1, and nuclear import was even missing after deletion of NLS2. Potential functional differences between the pUL97 isoforms and their individual impact on HCMV replication were investigated by recombinant HCMVs expressing single isoforms. CoIP experiments illustrated an isoform-specific interaction profile, showing that isoforms M1 and M74 were able to bind the pUL97 substrates pUL44 and pp65, while isoform M157 almost failed to interact. Moreover, the kinase activity of isoform M157 in terms of autophosphorylation as well as pp65 and histone substrate phosphorylation was substantially reduced compared to isoforms M1 and M74. In line with these data was the observation that exclusive expression of isoform M157 caused a 10-fold replication defect of HCMV, while isoforms M1 and M74 mediated viral replication characteristics very similar to wild-type. Taken together, this study provides evidence for the expression of three pUL97 isoforms, which are fine-regulated in their nuclear translocation, differ in their interaction and phosphorylation potential, and thus possess individual importance for HCMV replication.Seit mehr als zwanzig Jahren ist die Proteinkinase pUL97 aufgrund ihrer Rolle bei der Phosphorylierung des Medikaments Ganciclovir sowie ihrer ausgeprägten Multifunktionalität während der Replikation des humanen Cytomegalovirus (HCMV) Gegenstand intensiver Forschung. pUL97 akkumuliert überwiegend im Zellkern und reguliert dort grundlegende Schritte der viralen Replikation, wie die genomische DNA-Synthese, die Genexpression und den nukleären Kapsidexport. Der genaue Translokationsmechanismus von pUL97 in den Zellkern sowie viele biochemische und funktionelle Eigenschaften blieben bislang jedoch unklar. Die vorliegende Studie zeigt zum ersten Mal die Expression von drei verschiedenen pUL97-Isoformen während der HCMV-Infektion mit Laborstämmen sowie mit natürlich vorkommenden Isolaten. Mittels Plasmid-basierter Expressionskonstrukte und rekombinanter HCMVs wurde eine alternative Translationsinitiation an den Startcodons M1, M74 und M157 für die Ausbildung der Isoformen ermittelt. Sequenzanalysen zeigten eine Gesamtkonservierung und Restriktion dieser Startcodons auf humane Cytomegaloviren. Durch Immunfluoreszenzanalysen wurde die Position zweier Kernlokalisationssignale im größtenteils unstrukturierten N-Terminus zwischen den Aminosäuren 6-35 (NLS1) beziehungsweise 190-213 (NLS2) nachgewiesen. Beide NLS-Sequenzen wurden als zweiteilige Motive klassifiziert, sind unter HCMV-Stämmen hochkonserviert und interagieren mit dem Adaptermolekül Importin α. Zudem wurden NLS-Deletionsmutanten verwendet, um die Bedeutung von NLS1 und NLS2 für den effizienten Kernimport von pUL97 zu demonstrieren. Während die Deletion einer einzelnen NLS-Sequenz nur geringe Auswirkungen hatte, führte die gleichzeitige Deletion von NLS1 und NLS2 zu einem stark verminderten Kernimport von pUL97 und zu einem schweren Replikationsdefekt von HCMV. Interessanterweise war der Kernimport der N-terminal verkürzten Isoformen M74 und M157, welchen das NLS1 per se fehlt, eingeschränkt und wurde durch Deletion von NLS2 vollständig verhindert. Rekombinante HCMVs, welche einzelne Isoformen exprimierten, wurden verwendet, um funktionelle Unterschiede und den individuellen Einfluss der Isoformen auf die HCMV-Replikation zu ermitteln. CoIP-Experimente zeigten ein Isoform-spezifisches Interaktionsprofil, wobei die Isoformen M1 und M74 imstande waren, die Substratproteine pUL44 und pp65 effizient zu binden, während Isoform M157 nur schwach interagierte. Außerdem war die Kinaseaktivität der Isoform M157 im Hinblick auf die Autophosphorylierung sowie die Phosphorylierung von pp65 und Histonen gegenüber der Aktivität anderer Isoformen stark reduziert. Die alleinige Expression von Isoform M157 führte zum 10-fachen Replikationsdefekt von HCMV gegenüber der Wildtyp-ähnlichen Situation unter Bildung der Isoformen M1 und M74. Zusammenfassend liefert diese Studie den experimentellen Nachweis für das Auftreten von drei pUL97-Isoformen, welche sich in ihrer nukleären Translokation sowie ihrem Interaktions- und Phosphorylierungspotential unterscheiden und für die HCMV-Replikation individuelle Bedeutung besitzen