Funktionelle Charakterisierung von Typ-III Effektorproteinen in Pflanzen

Viele Gram-negative, für Pflanzen oder Tiere pathogene Bakterien verwenden ein Typ-III-Sekretionssystem (T3SS) um sog. Typ-III Effektorproteine (T3E) in das Zytoplasma ihrer eukaryotischen Wirtszelle zu translozieren. Diese Effektorproteine können als Virulenz-Faktoren wirken indem sie im Wirtsorganismus Veränderungen zum Vorteil des Pathogens hervorrufen. Prozesse und Zielstrukturen, die Effektoren sowohl in Pflanzen als auch in tierischen Zellen angreifen beinhalten z.B. das Zytoskelett, Abwehr- und Hormonantworten, die Ubiquitinierung, Transkription und den Vesikeltransport. Um sich gegen Pathogene zu schützen besitzen Pflanzen wie auch Tiere ein komplexes Immunsystem, das konservierte Moleküle der Pathogene erkennt, die als Pathogen-assoziierte molekulare Muster (pathogen-associated molecular patterns; PAMPs) bezeichnet werden. Die hierdurch ausgelöste Abwehrform wird in Pflanzen als PAMP-vermittelte Immunität (PAMP-triggered immunity; PTI) bezeichnet und bildet die erste Abwehrebene. Jedoch sind Pflanzenpathogene in der Lage die PTI durch die Translokation von Effektorproteinen zu unterdrücken. Als Antwort auf diese Effektoren entwickelten Pflanzen Resistenz-(R)-Proteine, die T3E spezifisch erkennen können und damit die sogenannte Effektor-vermittelte Immunität (effector-triggered immunity; ETI) aktivieren, die in Form von einem lokalisierten Zelltod, der Hypersensitiven Reaktion (HR), bakterielles Wachstum unterbinden kann. Für die Mehrzahl der bekannten T3E sind die Zielmoleküle innerhalb der Wirtszelle bisher nicht identifiziert. Die funktionelle Analyse von Effektorproteinen stellt daher einen wichtigen Baustein zum Verständnis von Virulenzstrategien bzw. von Abwehrmechanismen in eukaryontischen Wirtszellen da, wobei sich durch systemübergreifende Ansätze Gemeinsamkeiten in beiden Prozessen zwischen den Organismenreichen identifizieren lassen sollten.Ein Typ-III Effektor, der pflanzliche Abwehrprozesse unterdrücken kann, ist XopJ aus dem phytopathogenen Bakterium Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte ermittelt werden welchen Einfluss die Interaktion von XopJ mit der Proteasomuntereinheit RPT6 und der damit einhegenden Inhibition der Proteasomaktivität während einer Infektion von Paprika Pflanzen mit Xanthomonas campestris pv. vesicatoria besitzt. In planta und in vitro Interaktionsanalysen von XopJ mit der Proteasomuntereinheit RPT6 bestätigten eine spezifische Interaktion beider Proteine. Die Wechselwirkung beider Proteine an der Plasmamembran führte zu einer spezifischen Inhibition der Proteasomaktivität, die neben der Chymotrypsin-Aktivität auch die Caspase-ähnliche, d.h. zelltod-regulierende Aktivität des Proteasoms miteinschließt. In der kompatiblen Interaktion von Xanthomonas mit Paprika agiert XopJ als ein Virluenz-Faktor, der das bakterielle Wachstum begünstigt und die Ausbildung von Nekrosen verzögert. Daher sind Xcv ΔxopJ Mutanten im Wachstum beeinträchtigt und führten zu einer schnelleren Symptom-Entwicklung, die mit einer Nekrose in suszeptiblen Paprika Blätter einherging. Die Behandlung mit dem Proteasom-Inhibitor MG132 stellte die Fähigkeit von Xcv ΔxopJ wieder her, die Symptom-Entwicklung zu verzögern und deutet darauf hin, dass die Inhibition des Proteasoms durch XopJ eine Reduzierung der Symptomentwicklung zur Folge hat. Demnach korrelierte die XopJ-abhängige Verzögerung der Wirts-Zelltod-Reaktion mit einem verminderten Salizylsäure (SA)-Gehalt, einschließlich veränderter SA- und Seneszenz-assoziierter Genexpression, und abgeschwächter Proteasomaktivität während einer Infektion. Die Inhibition des Proteasoms unterdrückt auch basale Abwehr-Antworten wie die Sekretion von Proteinen oder Callose-Ablagerung und ist eine weitere Erklärung dafür wie XopJ Zellwand-basierte Abwehrreaktion supprimiert. Darüberhinaus konnte ein Zusammenhang zwischen der Proteasom-Aktivität und der SA-vermittelten Abwehrantwort erstellt werden, da die Herunterregulierung der Genexpression von NPR1, einem zentralen Regulator der SA Signalantwort, die Nekrose-Bildung nach Infektion mit Xcv ΔxopJ ausblieb. Die Infektion dieser Pflanzen löste keine Induktion der Proteasomaktivität auf und festigt die Annahme, dass die SA-Signalweiterleitung für die Aktivität des Proteasoms von essentieller Bedeutung ist. Der Mechanismus wie die Interaktion von XopJ und RPT6 die Proteasomaktivität beeinflusst ist noch nicht klar, dennoch gibt es Anzeichen, dass XopJ RPT6 an die Plasmamembran rekrutiert um eine Proteasom-unabhängige Degradierung von RPT6 zu fördern. Die anschließende Inhibition des Proteasmoms beeinträchtigt daraufhin SA-abhängige Abwehrantworten um die Wirts-Zelltod-Reaktion zu unterdrücken. Neben XopJ sollten im Rahmen dieser Arbeit auch andere Effektoren der YopJ-Familie identifiziert werden, die das Proteasom als Zielstruktur besitzen. Dabei konnte durch eine komparative Analyse ein XopJ-Homolog, der T3E PopJ aus Pseudomonas syringae pv. lachrymans entdeckt werden, der auch mit RPT6 in planta und Hefe interagiert. Wie XopJ besitzt PopJ eine charakteristische katalytische Triade und gehört damit zur YopJ-Superfamilie der Effektoren und ist durch sein Myristoylierungsmotiv an der Plasmamembran verankert. Die Interaktion mit RPT6 konnte mittels Bimolekulare Fluoreszenz Komplementation (BiFC) auch an der Plasmamembran nachgewiesen werden. Neben der strukturellen Konservierung scheint auch die Funktion beider Effektoren konserviert zu sein, da auch PopJ abhängig von dessen katalytischen Triade und Myristoylierung, die Proteasomaktivität reduzieren kann. Damit stellt die Manipulation des Proteasoms möglicherweise eine generelle Virulenz-Strategie unterschiedlich adaptierter Pathogene dar. Im letzten Abschnitt dieser Arbeit sollte durch einen system-übergreifenden Ansatz Typ-III Effektorproteine aus Tierpathogenen gefunden werden, die Immunreaktion in Pflanzen auslösen und möglicherweise konservierte Funktionen besitzen. Hierbei wurde SseF, ein T3E aus Salmonella enterica, identifiziert, der aktiv durch das pflanzliche Immunsystem wahrgenommen wird. Dabei löste SseF eine HR-ähnliche Antwort in N. benthamiana aus, sowohl nach transienter Expression durch Agrobakterien-vermittelte Transformation, als auch nach Translokation über das T3SS von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Die beobachtete HR-ähnliche Reaktion war möglicherweise von einem R-Protein der Klasse CC-NB-LRR abhängig. Die Translokation der AvrRpt2-SseF Fusion über das T3SS von Xcv führte zu einem reduzierten Wachstum dieser Bakterien in N. benthamiana, die aber in einer kompatiblen Interaktion mit Paprika Pflanzen zu einer beschleunigten Symptomentwicklung und erhöhten Virulenz beitrugen. Eine Mutationsanalyse ergab, dass die Region die für die Virulenz-Funktion in menschlichen Zellen erforderlich, für die Avirulenz-Funktion in pflanzlichen Zellen verantwortlich ist, was darauf hindeutet, dass die Funktion bzw. das Zielprotein system-übergreifend konserviert sein könnte.Many Gram-negative pathogenic bacteria of plants and animals use a type III secretion system (T3SS) to translocate type III effector proteins (T3Es) into the cytoplasm of their eukaryotic host cell. Type III effectors (T3Es) are able to act as virulence factors that effect changes in host cells to promote pathogen survival. Common effector target processes and structures in both animal and plant host cells include the cytoskeleton, defence and hormonal signalling, ubiquitination, gene expression, and vesicle trafficking. To protect themselves from pathogens, plant and animals possess a complex immune system that perceives conserved molecules of pathogens, called pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). This form of basal defence is termed PAMP-triggered immunity (PTI), which represents the first layer of defence. However, T3Es of phytopathogens are able to suppress the PTI. In turn, plants have evolved resistance (R) proteins that can recognize specific T3Es to induce an effector triggered immunity (ETI) that is often accompanied by rapid, localized cell death, termed the hypersensitive response (HR), which eventually restricts bacterial spread. Target proteins of many T3E remain mostly unknown. Thus, the functional analysis of effector proteins represents an essential tool to understand virulence strategies and defence mechanisms of eukaryotic host cells, while commonalities across kingdoms should be expected. One of the T3Es suppressing defense mechanisms is XopJ from the plant pathogenic bacteria Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv). The focus of the first part of this study was, how the interaction of XopJ and the proteasome subunit RPT6 influence the compatible interaction of Xcv and pepper plants. In planta and in vitro interaction studies confirmed a specific interaction of both proteins. The interaction of XopJ and RPT6 at the plasmamembrane resulted in a specific inhibition of the chymotrypsin- and caspase-like activity of the proteasome. During the compatible interaction of Xcv with pepper XopJ acts as a virulence factor promoting bacterial growth and delaying the onset of necrosis. Thus, Xcv ΔxopJ mutants are impaired in growth and display accelerated symptom development including tissue necrosis on susceptible pepper leaves. Application of the proteasome inhibitor MG132 restored the ability of Xcv ΔxopJ to attenuate the development of leaf necrosis. The XopJ dependent delay of tissue degeneration correlates with decreased levels of salicylic acid (SA), including changes in SA- and senescence associated gene expression, and attenuated proteasome activity during Xcv infection. The inhibition of the proteasome by MG132 prevents basal defence responses such as callose deposition and protein secretion explaining how XopJ is able to suppress cell wall-associated defence responses. Moreover, necrosis upon infection with Xcv ΔxopJ was greatly reduced in pepper plants silenced fpr NPR1, a central regulator of SA responses, demonstrating the involvement of SA-signalling in the development of XopJ dependent phenotypes. Despite the fact that the mechanism of how the interaction of XopJ and RPT6 inhibits the proteasome activity remains unclear, there is growing evidence that XopJ recruits RPT6 to the plasmamembrane to trigger its proteasome-independent degradation. This results in an inactivation of the proteasome to interfere with SA-dependent defence reactions to suppress host cell death reactions. Another aim of this study was to identify other YopJ-like effectors that are able to target the proteasome. Thereby, a comparative approach revealed a novel XopJ-like protein, the T3E PopJ from Pseudomonas syringae pv. lachrymans, interacting with RPT6 in planta and yeast. PopJ also contains a catalytic triade and hence belongs to the YopJ superfamily of effector proteins. PopJ is localised to the plasmamembrane in a myristoylation-dependent manner. Furthermore, BiFC analysis revealed a clear interaction of PopJ and RPT6 at the plasmamembran similar to the XopJ-RPT6 interaction. PopJ is also able to inhibit the proteasome activity dependent on its catalytic triade and correct localization indicating that alongside with the structural conservation there is a functional conservation of XopJ and PopJ. Therefore, the manipulation of the proteasome seems to be a convenient virulence strategy for pathogens that are adapted to different host plants. The focus of the last part of this thesis was to identify T3E from animal pathogens that trigger immune responses across kingdoms, in particular in plants, and hence probably exhibit conserved functions. This approach revealed that T3E SseF from Salmonella enterica is actively recognized by the plant immune system. SseF induced HR-like responses in N. benthamiana, either when transiently expressed in leaves of N. benthamiana by Agrobacterium tumefaciens infiltration or when delivered by Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) through the type III secretion system. The observed HR-like reaction was probably medieated by a yet unknown CC-NB-LRR resistance protein. Xcv translocating an AvrRpt2–SseF fusion protein was restricted in multiplication within leaves of N. benthamiana. Bacterial growth was not impaired but symptom development was rather accelerated in a compatible interaction with susceptible pepper plants. Furthermore, functional dissection of SseF revealed, that the region being essential for the virulence function in human cells, seems to be responsible for the avirulence function in plant cells, indicating a cross-kingdom conservation of SseF function