Adoptiver T-Zell-Rezeptor-Transfer zur Untersuchung der humanen T-Zell-Immunologie in vitro

Dendritic cells (DC) are known to be important orchestrators of the immune response, resulting in an effective adaptive immunity against pathogens. In therapeutic cancer vaccination, antigen (Ag)-loaded DC are used to initiate T-cell responses against tumors. An optimal cancer vaccine should induce a strong CD8+ CTL response and also promote T-cell help to support an effective CD8+ T-cell memory formation. However, the underlying cellular interactions of DC, T-helper cells, and CD8+ T cells are incompletely understood, notably in humans. Hence, the aim of this study was to generate human autologous Ag-specific in-vitro-systems to examine the communication between these cells and the effects of T-cell help on CTL priming vs. subsequent expansion. To make the control of antigen-specific interactions between DC and CD4+ T cells feasible, the specificity of the T cells was redirected by TCR-RNA electroporation. To obtain TCRs for equipping T cells with a new specificity, a fast and robust PCR-based method to clone functional TCRs was established. By the addition of a defined 5’ end, the cloning of TCR-chains without previous knowledge of the TCR-chain subtypes was enabled. The subsequent functional validation in a newly developed Jurkat T-cell assay showed that this assay is indicative for the functionality of the newly cloned TCRs in ex vivo isolated T cells, since the results correlated with the cytokine release, functional avidity, proliferative capacity, and tumor-cell recognition of freshly isolated TCR-transfected primary T cells. Consequently, the PCR-based cloning strategy in combination with the informative Jurkat T-cell assay provides a fast and low-cost method to clone and validate a TCR derived from T-cell clones. The Ag-specific cross-talk between human resting CD4+ T cells, reprogrammed by TCR-RNA transfection, and autologous peptide-loaded DC initiated Th1 cytokine secretion and induced T-cell activation and DC maturation. Moreover, the two suggested T-cell help models, i.e. the two-cell interaction model and the three-cell interaction model, were mimicked to elucidate the role of T-cell help in CD8+ T-cell priming and subsequent expansion. The sequential interaction of the DC, first with specific helper T cells to elicit DC licensing, and then, after these had been removed from the co-culture, with CD8+ T cells, barely improved CTL priming or expansion. In sharp contrast, a simultaneous interaction of all three cell types resulted in a significantly improved CTL expansion upon re-stimulation. Yet, this was only detectable, when both epitopes – the helper and the CD8 epitope – were presented by the same DC. In addition, the Ag-specific CD8+ T cells, generated in the presence of help provided in this three-cell interaction setting, showed a sustained CD27 expression, indicating memory formation. In conclusion, these findings might have several implications for DC vaccination strategies, since this human in vitro model system can be used to gain new insights in the molecular mechanisms involved in T-cell help, which then can be simulated by optimized DC vaccines.Dendritische Zellen (DC) sind für ihre Funktion als wichtige Organisatoren für Immunantworten bekannt, was in eine effiziente Einleitung der adaptiven Immunität gegen Pathogene resultiert. Im therapeutischen Ansatz der Krebsimpfung werden antigenbeladene DCs verwendet um T-Zell-Antworten gegen Tumore zu induzieren. Eine optimale Krebsimpfung sollte sowohl eine starke CD8+ CTL (zytotoxische T-Lymphozyten) Antwort induzieren, als auch T-Zell-Hilfe für eine effektive Generierung von CD8+ Gedächtniszellen fördern. Die zu Grunde liegenden zellulären Mechanismen der Interaktion zwischen DCs, T-Helferzellen und CD8+ T-Zellen sind jedoch insbesondere im humanen System nur unvollständig erfasst. Demzufolge war das Ziel dieser Arbeit die Generierung von humanen autologen antigenspezifischen In-vitro-Systemen, um die Kommunikation zwischen diesen Zellen und die Effekte der T-Zell-Hilfe auf das Primen von CTLs gegenüber der darauf folgenden Expansion zu untersuchen. Um die Kontrolle der antigenspezifischen Interaktion zwischen DCs und CD4+ T-Zellen zu ermöglichen, wurde die T-Zell-Spezifität durch Elektroporation von TCR (T-Zell-Rezeptor)-RNA umprogrammiert. Eine schnelle und stabile PCR-basierte Methode zur Klonierung funktioneller TCRs wurde etabliert um TCRs für die Ausstattung der T-Zellen mit einer neuen Spezifität zu erhalten. Durch das Anhängen eines definierten 5’ Endes wurde die Klonierung von TCR-Ketten ohne vorherige Kenntnis der Subtypen dieser TCR-Ketten ermöglicht. Die anschließende Validierung im neu entwickelten Jurkat T-Zell-System ergab, dass das Testsystem indikativ für die Funktionalität der neu klonierten TCRs in ex vivo isolierten T-Zellen ist, da dessen Ergebnisse mit der Zytokinsekretion, der funktionellen Avidität, der Proliferationskapazität und Tumorzellerkennung von frisch isolierten TCR-transfizierten primären T-Zellen korrelierten. Folglich stellt die PCR-basierte Klonierstrategie, in Kombination mit dem informativen Jurkat T-Zell-System, eine schnelle und kostengünstige Methode zur Klonierung und Validierung von TCRs, die von T-Zell-Klonen abstammen, dar. Der antigenspezifische Cross-Talk zwischen humanen ruhenden CD4+ T-Zellen, die durch TCR-RNA Transfektion umprogrammiert wurden, und autologen peptidbeladenen DCs initiierte eine Th1-Zytokinsekretion und induzierte sowohl T-Zell-Aktivierung, als auch DC-Reifung. Zudem wurden die zwei T-Zell-Hilfe-Modelle, d.h. das Zwei-Zell-Interaktions-Modell und das Drei-Zell-Interaktions-Modell, nachgeahmt, um die Rolle der T-Zell-Hilfe für das Primen der CD8+ T-Zellen und die anschließende Expansion aufzuklären. Die sequentielle Interaktion der DC, zuerst mit der spezifischen T-Helferzelle um eine DC Lizenzierung hervorzurufen und danach mit der CD8+ T-Zelle, nachdem die T-Helferzelle bereits aus der Ko-Kultur entfernt wurde, verbesserte das Primen und die Expansion der CTLs kaum. Im scharfen Gegensatz dazu resultierte die gleichzeitige Interaktion aller drei Zelltypen in eine signifikante Verbesserung der CTL Expansion nach Restimulation. Jedoch war dies nur detektierbar, wenn beide Epitope - das Helfer- und das CD8-Epitop - auf derselben DC präsentiert wurden. Zudem zeigten die CD8+ T-Zellen, die unter Bereitstellung von Hilfe im Drei-Zell-Interaktions-Setting generiert wurden, eine anhaltende CD27-Expression, was auf eine Gedächtniszellbildung hinweist. Zusammenfassend haben diese Ergebnisse etliche Auswirkungen auf DC-Vakzinationsstrategien, da dieses humane In-vitro-Modell verwendet werden kann, um neue Einblicke in die molekularen Mechanismen, die in der T-Zell-Hilfe involviert sind, zu gewinnen. Diese können dann in optimierten DC-Impfungen simuliert werden