Imobilização da inulinase de Klyveromyces marxianus var. bulgaricus ATCC 16045: caracterização e produção de açúcar invertido em biorreator

O interesse pela inulinase iniciou-se com a descoberta de sua habilidade de hidrolisar inulina, um polimero vegetal, em fmtose praticamente pura. A frutose é considerada uma alternativa segura como adoçante em relação à sacarose, sendo largamente utilizada na indústria de alimentos. As inulinases são geralmente tennoestáveis e comercialmente viáveis para aplicações industriais. Entretanto, uma produção contínua de frutose requer a utilização de uma inulinase imobilizada. Neste trabalho, o caldo fermentado, isento de células, de Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus foi imobilizado em vários suportes: carvão ativado, diatomito, casca de ovo, amberlite, sílica de porosidade controlada e gelatina. A mais alta taxa de imobilização foi obtida em gelatina (82,60%). Os métodos restantes avaliados não foram bem sucedidos, seja pela ausência de ligação protéica ou perda de atividade provocados pelo processo de imobilização. O pH ótimo da inulinase imobilizada foi o mesmo da enzima livre (3,5). As temperaturas ótimas foram 55 °C para a enzima livre e 60 °C para a inulinase imobilizada. O gráfico de Arrhenius apresentou-se linear e as energias de ativação foram 56,20 KJ/mol.°K (enzima livre) e 20,27 KJ/mol.°K (enzima imobilizada). Os parâmetros cinéticos foram calculados pelo gráfico de LineweaverBurk e os valores de Km e Vmax foram de 20,68 mg/mL e 37,73 UA/mg para a enzima livre; e 50,05 mg/mL e 31,64 UA!mg para a enzima imobilizada, respectivamente. A estabilidade operacional da inulinase imobilizada foi avaliada em reator tubular de leito fixo, durante 782 horas, apresentando 58,12% de atividade enzimática residual. Foi realizada uma cromatografia de camada delgada para uma análise qualitativa dos produtos da reação.The interest for inulinase began when it was discovered its ability to hydrolyse inulin, a vegetal polymer, in fructose practically pure. Fructose is considered as a safe altemative sweetener to sucrose, widely used in food industries. The inulinases are usually thermostable and cornmercially available for industrial applications. However, a continuous production of fructose requires the use of an immobilized inulinase. In this work, the crude enzyme broth free celis from Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus was imrnobilized on various supports: activated carbon, diatomite, hen egg shell, amberlite, porous silica and gelatin. The highest irnrnobilization yield was obtained in gelatin (82,60%). The remaining methods screened were not successful either because no protem binding occurred or irnmobilization process resulted in activity loss. The optimum pH of immobilized inulinase remained the sarne as that of free enzyme (3,5). The optimum temperatures were 55 °C for free enzyrne and 60 °C for the imrnobilized inulmase. The Arrhenius plot were linear and activation energies were 56,20 KJ/mol.°K (Free enzyme) and 20,27 KJ/rnol.°K (Immobilized enzyme). The kinetic parameters were calculated from Lineweaver-Burk plots and the values of Km and Vmax were 20,68 mg/mL and 37,73 UA/rng for free inulinase; and 50,05 rng/rnL and 31,64 UA/rng for immobilized enzyme, respectively. The operational stability of the immobilized inulinase was studied in continuous fixed bed colurnn reactor for 782 hours with 58,12% of residual activity. Thin layer chromatography was used for qualitative analysis of the reaction products.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq