Establishing a sensitive, Tet-regulated reporter system for the in vivo protein expression analysis in Salmonella Typhimurium

Für die Entwicklung neuer Therapeutika zur Prävention und Kontrolle von Salmonella-Infektionen ist eine genaue Kenntnis über das Proteom des Erregers während der Infektion für die damit einhergehende Identifizierung möglicher Angriffspunkte nötig. Daher wurde ein neuartiges Nachweissystem für die in vivo-Proteinexpressionsanalyse in Salmonella Typhimurium etabliert. Dessen Prinzip beruht auf der Induktion des Tet-Repressors (TetR) durch ein spezifisches, TetR-induzierendes Oligopeptid (TIP): wird ein mit TIP markiertes Protein exprimiert, induziert es TetR und damit die Transkription des von TetR reprimierten Reportergens. Dies ermöglicht den indirekten Nachweis der Expression des Trägerproteins. Nach Integration der Expressionskassetten für TetR und den TetR-kontrollierten Reporter in das Genom von S. Typhimurium wurde festgestellt, dass eine sensitive Induktion des Regulationssystems mit einem plasmidkodierten Fusionsprotein aus Thioredoxin 1 (Trx1) und TIP2 nicht möglich war. Da vermutet wurde, dass eine sehr hohe intrazelluläre Menge an TetR dafür verantwortlich war, wurde diese durch selektive Mutation im -10 Hexamer des TetR-exprimierenden cat-Promotors (Pcat) reduziert, was zur Erhöhung des TetR-Induktionsniveaus bzw. der Systemsensitivität führte. Weil diese jedoch nur marginal war, wurde zur weiteren Erhöhung der Sensitivität eine synthetische Promotorbibliothek durch randomisierte Mutation von vier Positionen innerhalb des Pcat 10 Hexamers erstellt. Aus 360 Kandidaten dieser Bibliothek wurde eine Mutante identifiziert, die durch drastische Reduktion der TetR-Menge eine deutlich höhere Sensitivität gegenüber einem natürlichen TetR-Induktor (Doxyzyklin) als die Stämme mit der selektiven Promotormutation und mit dem Wildtyp-Promotor aufwies. Auch für Fusionsproteine mit TIP2 erfolgte die TetR-Induktion in dieser Mutante sensitiver, da eine effiziente Induktion durch plasmidständige sowie durch im Genom kodierte, endogen exprimierte TIP2-Fusionen mit Trx1 und HPr möglich war. Jedoch konnte die endogene Expression der Salmonella-Virulenzfaktoren InvC und SseJ, nach Markierung mit TIP2, nicht mit dem Regulationssystem detektiert werden. Dies macht, trotz der bisher erreichten Verbesserungen, noch weiterführende Optimierung des Systems nötig. Das hier etablierte Regulationssystem kann nun als Modell bzw. als Basis für eine durch Protein/Peptid-Protein-Interaktionen vermittelte Signaltransduktionskaskade dienen. Damit kann es zur Entwicklung einer neuartigen Methode für die in vivo-Proteinexpressionsanalyse von Pathogenen wie S. Typhimurium herangezogen werden. Dies könnte zur Aufklärung des Proteoms eines Erregers während einer Infektion und damit zum besseren Verständnis seiner Pathogenität beitragen.Developing new therapeutics to prevent and control Salmonella infections requires detailed knowledge of the pathogen’s proteome during the course of an infection for the subsequent identification of possible drug targets. This is difficult to achieve with existing methodology. Therefore, a novel detection system for in vivo protein expression analysis was established in Salmonella Typhimurium. It is based on the induction of the Tet repressor (TetR) by a specific TetR inducing oligopeptide, called TIP. If a TIP-tagged protein is expressed, it induces TetR and, hence, the transcription of a reporter gene repressed by TetR. This, indirectly, provides evidence for the expression of the TIP-carrying protein. After integrating the expression cassettes for TetR and the Tet-controlled reporter into the genome of S. Typhimurium, it was not possible to observe sensitive induction of the regulatory system with a plasmid-encoded fusion protein consisting of thioredoxin 1 (Trx1) and TIP2. Since it was assumed that a high intracellular steady-state level of TetR was responsible for this lack of sensitivity, the -10 hexamer of the TetR expressing cat promoter (Pcat) was selectively mutated to reduce the TetR amount. This resulted in increased system sensitivity and TetR induction levels, but the improvements were only marginal. In order to further enhance sensitivity, a synthetic promoter library was generated by random mutation of four positions in the Pcat -10 hexamer. One mutant, out of 360 library candidates, was finally chosen, because it exhibited not only a drastically reduced TetR steady-state level, but also a significantly higher sensitivity towards a natural TetR inducer, doxycycline, compared to the strains containing either the selective promoter mutant or the wildtype promoter. The mutation also improved the sensitivity of induction for TIP2 fusion proteins, as efficient induction by plasmid- as well as chromosomally-encoded and endogenously expressed fusions of TIP2 to Trx1 and HPr was measured. However, endogenous expression of the Salmonella virulence factors InvC and SseJ, when tagged with TIP2, was not detected with the regulatory system. This implies that further optimization of the system’s sensitivity might still be necessary. The regulatory system established here can now serve as a starting model or as the basic module for a signal transduction cascade that is controlled by protein/peptide-protein interactions. Thus, it can be exploited to develop a novel method for in vivo analysis of protein expression in pathogens like S. Typhimurium and, therefore, could contribute to elucidating the pathogen’s proteome during individual steps of the infection process, advancing our understanding of the organism’s pathogenicity