The role of microRNAs in prostate cancer.

Das Prostatakarzinom ist in Deutschland die am häufigsten vorkommende Krebserkrankung beim Mann. Die Ursachen dieser Erkrankung sind weitestgehend unbekannt, wobei neben dem Alter auch eine genetische Prädisposition sowie Faktoren wie Ernährung diskutiert werden. Die Diagnostik des Prostatakarzinoms findet bislang zum einen mittels digital rektaler Tastuntersuchung statt, wobei hier nur etwa 2-5% der Tumore entdeckt werden und zum anderen über die Messung des prostataspezifischen Antigens (PSA). Der PSA Level wird jedoch von patientenabhängigen Größen wie z.B. Prostatagröße, Harnwegsinfekte und therapeutische oder diagnostische Eingriffe am unteren Harntrakt beeinflusst, sodass eine Erhöhung des PSA-Wertes nicht unbedingt mit einer bösartigen Veränderung der Prostata zusammenhängt. Das Ziel ist, genauere Marker für die Diagnose und Prognose zu finden. MicroRNAs (miRNA) sind kleine RNAs von 19-22 Nukleotiden Länge, welche etwa 30% aller menschlichen Gene regulieren. In mehreren Arbeiten wurde bereits gezeigt, dass miRNAs eine zentrale Rolle bei physiologischen und pathologischen Prozessen, wie bei der Zelldifferenzierung, Zellzykluskontrolle, Proliferation, Apoptose und über die Regulation dieser Prozesse auch bei der Entstehung von Krebs spielen. Das erste Ziel dieser Arbeit war die Erstellung eines globalen miRNA Expressionsprofiles im Prostatakarzinom. Hierzu wurden Sequenzierungs- und miRNA microArray-Analysen durchgeführt. Mit beiden Ansätzen wurden sieben miRNAs (miR-375, miR-200c, miR-106a, miR-106b, let-7a, miR-21, miR-20a) hochreguliert und zwei miRNAs (miR-145, miR-221) herunterreguliert gefunden. Die Expression der am stärksten dereguliert exprimierten miRNAs (miR-375, miR-200c, miR-145) und zusätzlich miR-143 wurde mittels quantitativer real-time Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR) in Prostatazelllinien und zwei Kollektiven von Primärgeweben untersucht und die Art der Deregulation (hoch- bzw. herunterreguliert im Tumor) konnte für alle bestätigt werden. Mittels bioinformatischer Recherche wurden für alle vier miRNAs Zielgene (MYO6, SEC23A, ERG) identifiziert. Deren Expression wurde ebenfalls mittels qRT-PCR in Prostatazelllinien und einem Kollektiv von Primärgeweben analysiert und für alle drei Zielgene konnte eine inverse Expression zu der jeweiligen miRNA gefunden werden. Außerdem wurde der Einfluss der Deregulation der miRNAs miR-375, miR-200c und miR-145, sowie von Sec23A und ERG in vitro untersucht. Knockdown von miR-375 und miR-200c führte zu einer Veränderung der zellbiologischen Paramter Proliferation, Viabilität, Zytotoxizität, Apoptose und Wundheilung. Ebenso konnte ein Einfluss der Deregulation von Sec23A auf die untersuchten zellbiologischen Parameter festgestellt werden. Für ERG wurde sowohl die Gesamt-ERG Expression als auch die Expression einzelner Spleißvarianten untersucht. Die Expression von Gesamt-ERG und für die ERG-2 Spleißvariante wurde im Tumor hochreguliert gefunden. Nach ERG-2 Knockdown und ektoper Expression von miR-145 wurden ebenfalls reziproke Auswirkungen auf Proliferation und Invasionsverhalten festgestellt. Auf Proteinebene wurde sowohl für die Gesamt-ERG-Proteinmenge als auch für ERG-2 eine Korrelation mit der miR-145 Expression gefunden. Da die miRNA Expression ein differenzielles Muster zwischen Tumor- und Normalgewebe zeigte, wurde das diagnostische Potential der miRNAs mittels binärer logistischer Regressionsanalysen untersucht. Eine Kombination der miRNAs miR-375, miR-145 und miR-143 zeigte hierbei den besten prädiktiven Wert zur Unterscheidung von Tumor- und Normalgewebe. Diese Befunde unterstreichen die Funktion von miRNAs als vielversprechende diagnostische Marker für das Prostatakarzinom, sowie als Wegbereiter zur Identifizierung von neuen tumorrelevanten Genen, welche in der Zukunft als mögliche therapeutische Ziele oder prognostische Marker dienen können.Prostate cancer is the most frequent cancer in men in Germany. The causes of this disease are mostly unknown, however, besides the patient’s age a genetic predisposition as well as factors like nutrition are discussed. Methods for the diagnosis of prostate cancer are currently digital rectal examination and measurement of the prostate specific antigen (PSA). However, both methods have limitations as for the digital rectal examination only 2-5% of the tumors are found by this examination method and the PSA level differs due to patient dependent causes like the size of the prostate, urinary tract infections and therapeutic or diagnostic operations of the lower urinary tract, leading to an increased PSA level which is not necessarily correlated to a malignant lesion of the prostate. The goal is to find more precise markers for the diagnosis and later on the prognosis of prostate cancer. MicroRNAs (miRNA) are small regulatory RNAs of 19-22 nucleotides length, regulating the expression of approximately 30% of the human genes. Several publications already showed a central role for miRNAs in physiologic and pathologic processes like cell differentiation, cell cycle control, proliferation, apoptosis and via the regulation of these processes an important role in cancer development. The first aim of this study was to obtain a global miRNA expression profile of prostate cancer, therefore sequencing and miRNA microarray analyses were performed. With both techniques seven miRNAs (miR-375, miR-200c, miR-106a, miR-106b, let-7a, miR-21, miR-20a) where found to be upregulated and two miRNAs (miR-145, miR-221) were found to be downregulated. The expression of the most deregulated miRNAs (miR-375, miR-200c, miR-145) and additionally miR-143 was analyzed by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) in prostate cell lines and two collectives of primary prostate tissue. The pattern of deregulation (up or down in tumor) predicted from sequencing and miRNA micorarray could be confirmed for all of the miRNAs. Using a bioinformatical approach, target genes (MYO6, SEC23A, ERG) for the four miRNAs were identified. The expression of the target genes was measured using qRT-PCR as well and an inverse expression of target gene and related miRNA was found. Moreover, the impact of the deregulated expression of miR-375, miR-200c and miR-145 as well as for Sec23A and ERG was examined in vitro. Knockdown of miR-375 and miR-200c led to changes in proliferation, viability, cytotoxicity, apoptosis and wound healing. The deregulation of Sec23A showed a similar impact on the examined cell biological parameter. For ERG the overall expression as well as the expression of different splice variants was examined. The overall ERG expression and the expression of the ERG-2 splice variant were found to be upregulated in prostate cancer. Knockdown of ERG-2 and ectopic expression of miR-145 led to reciprocal effects in proliferation and invasion. On protein level a correlation between the protein amount of ERG total and ERG-2 with the miR-145 expression was found. As the expression of miRNAs showed a specific pattern for tumor and normal tissue binary logistic regression was done to investigate the diagnostic potential of the miRNAs. A combination of the miRNAs miR-375, miR-145 and miR-143 showed the best predictive value to discriminate between normal and tumor tissue. These findings underline the promising role of miRNAs as diagnostic markers in prostate cancer. Moreover studying miRNAs and their target genes might lead to the identification of new tumorrelevant genes which might serve as therapeutic targets or prognostic markers in the future