Comparison of DNA-repair in tumour and oral mucosa cells

1.1 Hintergrund und Ziele Bei der Behandlung des Mundhöhlenkarzinoms spielt die Anwendung ionisierender Strahlen derzeit eine entscheidende Rolle, meist im Zusammenspiel mit Operation und Chemotherapie. Trifft Strahlung auf das Gewebe, werden in den exponierten Zellen erhebliche Schäden erzeugt. Auf direktem und indirektem Weg führt die Strahlung zu Schäden in der DNA, wobei hier besonders die Doppelstrangbrüche als schwierig zu reparierende Schäden gelten. Ziel dieser Arbeit ist es, herauszufinden, wie stark die Reaktionen bei Bestrahlung des Tumorgewebes bzw. des normalen Mundschleimhautgewebes ausfallen; hierbei wurde sowohl die Anzahl der entstandenen Schäden und die Reparaturfähigkeit betrachtet als auch die Induktion verschiedener Strukturen, die in den Reparaturprozess involviert sind. Dabei interessierte besonders die Frage, ob Zellen der oralen Plattenepithel (PLE) - Karzinome sensitiver auf Bestrahlung reagieren als Normalgewebe und welche Unterschiede im Reparaturverhalten der verglichenen Gewebe auftreten. 1.2 Methoden Nach Entnahme des Zellmaterials aus PLE-Karzinomen der Mundhöhle und normalen Mundschleimhautzellen wurden diese für die Behandlung vorbereitet und anschließend mit jeweils 2 Gy bestrahlt. Im Folgenden wurden mittels Immunostaining die Proteine Atm, H2AX, Pml und p53 angefärbt sowie die Zellkerne markiert. Dieses Vorgehen erfolgte sowohl eine, drei und 24 Stunden nach Bestrahlung als auch an einer nicht bestrahlten Kontrolle. Mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskops wurden diese Proteine als Foci sichtbar gemacht und zusammen mit den Zellkernen derselben Stelle in zwei getrennten Bildern aufgenommen. Die Auswertung erfolgte durch das Bildanalyseprogramm Biomas. 1.3 Ergebnisse und Beobachtungen Nach Bestrahlung kam es in den normalen Zellen zunächst zu einem signifikanten Anstieg des Atm (p=0,002, Vergleich zur unbestrahlten Kontrolle), nach drei Stunden ging die Anzahl deutlich zurück (p=0,001), nach 24 Stunden wurde der Ausgangswert wieder knapp erreicht. Im Gegensatz dazu zeigte sich im Tumorgewebe keinerlei Anstieg des Atm. Die Verläufe von H2AX zeigten sich in beiden Geweben ähnlich mit einem signifikanten Anstieg nach einer Stunde (p=0,001 bei normalen Zellen) und einem sich anschließenden Abfall nach drei Stunden (p=0,001 bei normalen Zellen) und 24 Stunden, hierbei wurde das Ausgangsniveau jedoch nicht wieder erreicht. Bei Pml konnte im Normalgewebe im Verlauf von drei Stunden keine wesentliche Veränderung zur Kontrolle beobachtet werden, erst nach 24 Stunden zeigt sich ein Anstieg von 14 auf 21 Foci/Zelle. Parallel dazu präsentieren sich die Pml-Foci des Tumorgewebes, die jeweils ca. 10 Foci/Zelle weniger aufweisen. Betrachtet man p53, so ist hier ebenfalls nach einer und drei Stunden sowohl in normalen als auch in Tumorzellen kein Anstieg feststellbar, im gesunden Gewebe kommt es erneut nach 24 Stunden zu einem Anstieg (von ursprünglich elf auf knapp 15 Foci/Zelle), der bei den PLE-Proben allerdings ausbleibt, der Wert bleibt mit jeweils ca. sieben Foci/Zelle im zeitlichen Verlauf konstant. 1.4 Praktische Schlussfolgerungen Es konnte gezeigt werden, dass nach Bestrahlung sowohl im normalen als auch im Tumorgewebe zahlreiche Doppelstrangbrüche (=DSB) induziert werden. Die im Vergleich etwas verminderte Zahl im Tumorgewebe lässt sich mit mangelnder Detektion infolge des fehlenden Atm erklären. Aufgrund verminderter Expression der zur Reparatur notwendigen Proteine (50% weniger Pml und p53) wird es für die Tumorzelle deutlich schwieriger, auf Schäden zu reagieren. Deshalb kann davon ausgegangen werden, dass die wiederholte Bestrahlung des Gewebes den gesunden Zellen ausreichend Zeit zur Regeneration lässt, während sie bei Tumorzellen durch Akkumulation komplexer Schäden schließlich den Zelltod bewirkt. Mutiertes Atm scheint dabei ein Merkmal der fortgeschrittenen Kanzerogenisierung zu sein, während normale Zellen durch intaktes Atm einen größeren Schutz besitzen.2.1 Background and aims Application of ionising radiation mostly combined with surgery and chemotherapy plays an important role in the cancer treatment of the oral cavity. The biological effects of radiation are thought of in terms of their effects on living cells. Ionizing radiation may directly or indirectly damage DNA and induce irreparable DNA double-strand breaks. The aim of this study was to investigate the effects of irradiation on tumour and oral mucosa cells. We determined the level of DNA damage of the squamous cell cancer cells, the ability of cells to repair, the activation of proteins involved in DNA-repair and compared this with normal tissue. Moreover the different sensitivity to ionising radiation and DNA repair capacity in both type of cells were evaluated. 2.2 Methods The squamous-cell carcinoma and the normal oral cavity primary cell lines obtained from patients with HNSCC were irradiated with 2 Gy X-rays. Using immunostainig the proteins Atm, H2AX, Pml, p53 and the nuclei were marked one, three and 24 hours after irradiation and additionally an unirradiated control. Via fluorescence microscopy and an image analysis software two images were acquired. The foci were visualized and superimposed to the nucleus and the numbers of foci per cell were analysed. 2.3 Results and observations The normal tissue showed after irradiation a significant increase of Atm foci (p=0.002, compared to unirradiated control), a cleary decrease after three hours and achieved the initial level after 24 hours. In the tumour cells no increase of Atm was noticed. H2AX developing appeared similarly in both tissues with an increase after one hour, a decrease after three and 24 hours, but the initial value was not achieved. The intracellular accumulation of PML in the normal cells after 3 hours did not differ from control level. Primary after 24 hours an increase from 14 to 21 Foci/cell was observed. Similar results were obtained for tumour cells. The average p53 foci amount in both cell lines did not change both 1 and 3 hours after irradiation. The maximal level of 15 foci/cells was reached in normal cells following 24 hours. The p53 level in tumour cells was constant with approximately 7 foci/cell. 2.4 Conclusion It could be demonstrated that DSBs could be induced numerously in normal and tumour cells after irradiation. The decreased level of DSBs in neoplastic tissue could be caused by reduced expression or absence of Atm. Moreover the data presented suggests that the lower expression of proteins involved in DNA-repair Pml and p53 by tumour cells could result in increased level of DNA damage. Thus re-irradiation has only a limited effect on normal tissue but the intracellular accumulation of irreparable DSBs in tumour cells can cause apoptosis. Mutated Atm seems to play a decisive role in cancerogenesis, while normal tissue could exhibit a higher protection level by reason of faultless Atm