Antiatherosclerotic properties of Resveratrol: Molecular and functional effects on human endothelial cells and monocytes

Hintergrund: Das Französische Paradox hat die Aufmerksamkeit der kardiologischen Forschung auf das Polyphenol Resveratrol gelenkt und zahlreiche Forschungsprojekte dienten bereits zur genaueren Analyse der kardioprotektiven Wirkung. Der Einfluss von Resveratrol auf die Entstehung und Progression atherosklerotischer Plaques verspricht große Hoffnungen für den Einsatz als medikamentöse Therapie. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit neuen Wirkungsweisen von Resveratrol in der Atherogenese. Dazu wurde dessen Effekt auf die Morphologieänderung und das Migrationsverhalten von Endothelzellen und den zugehörigen Signalkaskaden untersucht. In weiteren Versuchen wurde in Endothelzellen die durch TNF-α induzierte Expression von Adhäsionsmolekülen analysiert. THP-1-Monozyten wurden stellvertretend für humane Monozyten zur Durchführung eines Chemotaxis-Versuchs mit Resveratrol verwendet. Weiterhin wurde der Einfluss von Resveratrol auf die Expression von Cathepsin L in humanen Makrophagen erforscht. Methoden: Für die Beurteilung des Migrationsverhaltens wurden die Endothelzellen mit 1-20 µM Resveratrol vorbehandelt und die Migration mit Hilfe eines Lichtmikroskops mit Kamera festgehalten. Die beteiligten Signalwege wurden durch die Behandlung der Endothelzellen mit Resveratrol in 10 µM, BAY 11-7082 (Inhibitor des NF-ϰB-Signalweges), Simvastatin (Inhibitor der RhoA Isoprenylation) oder Hydroxyfasudil (Rho-Kinase-Inhibitor) untersucht. Der Immunfluoreszenzversuch wurde mit Endothelzellen durchgeführt, die mit 10 µM Resveratrol und z. T. mit 1 µM Simvastatin oder 10 µM Y-27632 als Inhibitoren des Rho A-Signalweges vorbehandelt worden sind. Die Auswertung erfolgte nach Fixation und Färbung im Fluoreszenzmikroskop. Für die Analyse der Proteinexpressionen wurden die Endothelzellen mit den Resveratrolkonzentrationen 1-50 µM vorbehandelt und anschließend mit 2,5 ng/ml TNF-α stimuliert. Die Vorbehandlung der Makrophagen erfolgte in den Resveratrolkonzentrationen 1-50 µM und die anschließende Stimulation wurde mit 0,1 µg/ml LPS durchgeführt. Die Bestimmung der Proteinexpression in Endothelzellen (VCAM-1 und E-Selektin) und in Makrophagen (Cathepsin L) erfolgte mittels Western Blot Analyse. Die THP-1-Monozyten zur Durchführung des Chemotaxisversuches wurden mit Resveratrol in den Konzentrationen 1-50 µM vorbehandelt und dieser wurde nach erfolgter Migration in der Chemotaxis-Kammer mit 5 ng/ml MCP-1 mittels Lichtmikroskop und Zählkammer ausgewertet. Ergebnisse: Die Vorinkubation mit Resveratrol bewirkte eine Elongierung der Endothelzellen. Dies geschah über die Aktivierung eines Rho A-abhängigen Signalweges, welcher auf das Aktin-Zytoskelett einwirkt. Weiterhin beeinflusste Resveratrol konzentrationsabhängig das Migrationsverhalten der Endothelzellen. Bei den Resveratrolkonzentrationen 10 µM und 20 µM war der zellfreie Abschnitt zwischen zwei Zellrasen nach 24 Stunden noch nicht zu 50% verschlossen. Der zugrunde liegende Wirkmechanismus beruhte auf der Aktivierung eines Rho-Kinase-abhängigen Signalweges. Auch die Proteinexpression von VCAM-1 und E-Selektin in Endothelzellen wurde konzentrationsabhängig gehemmt. Resveratrol hemmte konzentrationsabhängig die Chemotaxis von THP-1-Monozyten bezüglich des Chemokins MCP-1. Bei der höchsten verwendeten Konzentration von 50 µM war die Chemotaxis im Vergleich zur Kontrolle sehr stark beeinträchtigt. Auf die Expression von Cathepsin L in Makrophagen konnte kein signifikanter Effekt von Resveratrol beobachtet werden. Schlussfolgerungen: Resveratrol greift auf verschiedene Weise in die Atherogenese ein. Es hemmt die Rekrutierung von Leukozyten einerseits durch die verminderte Expression endothelialer Adhäsionsmoleküle und andererseits durch eine verminderte Chemotaxis der Monozyten. Endothelzellen verändern unter Resveratrolbehandlung in vitro ihre Morphologie und Signaltransduktionswege. Der inhibierende Einfluss auf das Migrationsverhalten der Endothelzellen könnte in vivo in einer verminderten Neoangiogenese resultieren, was sich positiv auf die Plaquedestabilisierung auswirken könnte. Resveratrol weist somit verschiedene Angriffspunkte in der Atherogeneseinhibition auf und gibt dadurch Anlass zur Hoffnung, in der Atherosklerosetherapie verwendet werden zu können.Background: The “French paradox” drew the attention of cardiologic research on Resveratrol, a compound in red wine, which is known for its antioxidative action. Hereupon several studies started to investigate potential cardioprotective effects of the antioxidative substance. The explored beneficial impact of Resveratrol on the both development and progression of atherosclerosis raises hope for a therapeutic application. The present study investigates new modes of action of Resveratrol in atherogenesis. We analyzed the effect on both morphology and migration of endothelial cells and on the underlying signaling cascades. In addition, the TNF-α induced expression of adhesion molecules in endothelial cells was investigated. THP-1-monocytes were used for chemotaxis assays with Resveratrol. Furthermore we investigated the influence of Resveratrol on the expression of Cathepsin L in human macrophages. Methods: To evaluate the migration of endothelial cells, they were treated with Resveratrol 1-20 μM and the migration behavior was analyzed under a light microscope. The involved signaling cascades were investigated by endothelial cells treated with Resveratrol 10 μM, BAY 11-7082(inhibitor of NF-KB-signaling cascade), Simvastatin (inhibitor of RhoA Isoprenylation) or Hydroxyfasudil (Rho-Kinase-inhibitor). The immunfluorescence-assay were performed by incubating endothelial cells with 10 μM Resveratrol and 1 μM Simvastatin or 10 μM Y-27632 as inhibitor of the Rho-A-signaling cascade. The analyses were carried out under a fluorescencemicroscope after fixation and staining of the cells. For translation analyses, endothelial cells were treated with Resveratrol 1-50 μM and stimulated with 2,5 ng/ml TNF-α. Macrophages were incubated with Resveratrol 1-50 μM and stimulated with 0,1 μg/ml LPS. Thereupon protein expression in endothelial cells (VCAM-1 and E-Selectin) and in macrophages (Cathepsin L) was quantified using western blot analysis. Chemotaxis assay was carried out by stimulation of THP-1 monocytes with Resveratrol 1-50 μM. The evaluation was performed in a chemotaxis chamber, where migration of the pretreated monocytes was induced by the incubation with 5 ng/ml MCP-1. Results: The application of Resveratrol affected the elongation of endothelial cells, by the activation of a RhoA-dependend signaling cascade, which is involved in the regulation of the actin cytoskeleton. Furthermore, Resveratrol inhibited the migration of endothelial cells in a dose-dependent manner. The underlying mechanism was based on the activation of a Rho-Kinase dependend signaling cascade. The protein expression of VCAM-1 and E-Selectin in endothelial cells was also dose-dependendly inhibited. In addition, increasing concentrations of Resveratrol suppressed the MCP-1 induced chemotaxis of THP-1-monocytes. Accordingly, when compared to the control, chemotaxis of THP-1-monocytes was almost completely inhibited after incubation with the highest dose of Resveratrol (50 μM). No significant effects were detected concerning the expression of Cathepsin L in macrophages. Conclusions: Several modes of action seem to be involved in the atheroprotective effects of Resveratrol. Both the decreased expression of endothelial adhesion-molecules and an inhibited chemotaxis of monocytes suppress the recruitment of leukocytes. Apart from that, Resveratrol causes changes in the morphology of endothelial cells and affects a Rho-Kinase-dependent signaling cascade. The suppressed migration of endothelial cells might result in a decreased neoangiogenesis, which prevents the process of plaque-destabilisation. To conclude, Resveratrol exhibits different modes of action to attenuate the atherogenetic process, which raises hope for a new therapeutical approach against atherosclerosis