Interplay of hemodynamic forces and inflammatory processes in the development of atherosclerosis

Atherosklerose ist eine progressive entzündliche Erkrankung der großen Arterien, die lange Zeit symptomlos bleibt und sich schließlich akut oder in chronischer Form manifestieren kann. Es handelt sich dabei um eine Verhärtung der Gefäße durch Lipideinlagerungen und Bildung von so genannten atherosklerotischen Plaques in der inneren Schicht der Arterienwand (Intima). Arterielle Bifurkationen oder Biegungen sind Gefäßabschnitte, die besonders anfällig für die Entstehung von Atherosklerose sind. In diesen Bereichen herrschen nicht-uniforme Strömungsverhältnisse mit quantitativ geringeren Scherkräften (non-uniform shear stress), was zu einer Aktivierung des Endothels in diesen Bereichen führt. Im Gegensatz dazu sind die Strömungs¬bedingungen in nahezu gerade verlaufenden Gefäßabschnitten sehr gleichmäßig und die Scherkräfte, die auf das Endothel wirken, hoch (laminar shear stress). Unter diesen Bedingungen zeigen Endothelzellen einen antiatherogenen Phänotyp. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Endothelzellfunktion, sowohl unter laminaren als auch nicht-uniformen Strömungs¬bedingungen. Es wurde ein Bifurkationsmodell verwendet, das ein verlässliches in vitro-Modell darstellt, um die Strömungsverhältnisse ähnlich denen an Gefäßbifurkationen zu untersuchen. Darüber hinaus wurde die Rolle eines mechanosensorischen Komplexes mit dem Fokus auf VEGFR2 (vascular endothelial growth factor 2) unter atherogenen Strömungsbedingungen untersucht. VEGFR2 ist eine Rezeptortyrosinkinase, die eine entscheidende Rolle in der endothelialen Mechanotransduktion spielt. Da eine Deletion des vegfr2-Gens in VEGFR2-defiziente Mäusen aufgrund beeinträchtigter embryonaler Gefä߬bildung zur fötalen Letalität führt, waren in vivo-Experimente in diesem Zusammenhang nicht möglich. Im abschließenden Teil der Arbeit wurde untersucht, ob pharmazeutische Substanzen (Sartane) mit antiinflammatorischen Eigenschaften auf Endothelzellebene in ähnlicher Weise wirken können wie anti¬atherogene laminare Strömungsverhältnisse. Es wurde gezeigt, dass aufgrund nicht-uniformer Strömungen mechano¬sensitive Signalkaskaden induziert werden, welche die Endothelzellen für zirkulierende inflammatorische Zytokine sensibilisierten. Zudem kam es in diesen Bereichen unter Einfluss von TNF-α zu einer erhöhten Expression der Adhäsionsmoleküle VCAM-1 und E-Selektin sowie zu einer verstärkten Interaktion zwischen Leukozyten und dem Endothel. Im Gegensatz dazu waren Zellen in Bereichen laminarer Scherkräfte gegen die TNF-α-abhängige Induktion der Adhäsionsmoleküle und Leukozytenrekrutierung geschützt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Scherkräfte für die Zytokin-abhängige Endothelzellreaktion entscheidend waren, denn die deutlichen Unterschiede zwischen laminaren und nicht-uniformen Bereichen nach TNF-α Stimulation verschwanden, sobald die Zellen vor TNF-α Gabe statischen Bedingungen ausgesetzt waren. Die Untersuchung der Signalverarbeitung mechanischer Stimuli zeigte, dass ein Knockdown von VEGFR2 zu einer inhibierten NF-κB Translokation vom Zytoplasma in den Zellkern führte – ein entscheidender Schritt in der intrazellulären Signaltransduktion und anschließenden Genexpression. Zudem wurden die Adhäsions-moleküle sowie die THP-1 Monozytenrekrutierung an das aktivierte Endothel unter nicht-uniformen Scherkräften durch Blockierung von VEGFR2 reduziert. Die Inhibierung weiterer Proteine (Phosphoinositol-3-Kinase, Src-Kinase, Fokale Adhäsionskinase) in der Signalverarbeitung gab einen Hinweis auf mögliche intrazelluläre VEGFR2 Signalkaskaden in Endothelzellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten die Scherkraft-vermittelten endothelialen Reaktionen in einem gut charakterisierten in vitro-Bifurkationsmodell. Dennoch sind weitere Untersuchungen essentiell, die die zellulären Mechanismen der endothelialen Dysfunktion als frühen Schritt der Atherogenese sowie die involvierten inflammatorischen Signalwege, die unter nicht-uniformen Strömungsbedingungen induziert werden, aufklären. Nur so können neue Optionen für therapeutische Interventionen der Atherosklerose und ihren Begleiterkrankungen gefunden werden.Atherosclerosis is a progressive inflammatory disease of the big arteries which can remain asymptomatic for a long time and finally manifests itself acutely or in chronic form. During atherogenesis lipid accumulation in the vessels and plaque formation occurs within the inner layer of the artery wall (intima). Atherosclerosis-prone regions, e.g. arterial bifurcations are characterized by non-uniform shear stress pattern which induce endothelial activation. On the contrary, laminar blood flow induces a quiescent endothelial cell phenotype. The present thesis focused on the endothelial responses to laminar and non-uniform shear stress in bifurcating flow-through cell culture slides, which represent a reliable in vitro model reflecting shear stress conditions at bifurcations. Subsequently, the analyses of the role of an endothelial mechanosensory complex activated in the non-uniform shear stress regions were carried out, with particular focus on vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2), a tyrosine kinase receptor, which plays a key role in endothelial mechanotransduction. As VEGFR2-deficient animals die due to a failure of embryonal blood vessel formation, our model provides suitable settings to substitute in vivo studies. Finally, we investigated the possibility of pharmacological mimicking of the laminar shear stress effects using anti-inflammatory substances (sartans). Our studies demonstrated that non-uniform shear stress activated endothelial cells and induced a dramatic increase in endothelial expression of vascular cell adhesion molecule (VCAM)-1 and E-selectin, and in monocytic cell recruitment in response to TNF-α. On the contrary, endothelial cells exposed to laminar shear stress were essentially protected against TNF-α-induced upregulation of adhesion molecules and monocytic cell recruitment. We further showed the critical role of shear stress in the endothelial responsiveness to cytokines. Namely, the significant differences in TNF-α-induced monocytic cell recruitment and adhesion molecule expression between laminar and non-uniform shear stress regions were abolished in the absence of shear stress preconditioning. Detailed investigations of mechanotransduction pathways showed that a VEGFR2 knockdown significantly prevented NF-κB translocation to the nucleus, which is a crucial step during intracellular signaling leading to gene expression. Furthermore blocking the receptor functionality reduced monocytic cell recruitment to the endothelium under non-uniform shear stress, accompanied by decrease in VCAM-1 and E-selectin protein levels. Inhibition of kinases downstream of VEGFR2 (phosphoinositol-3-kinase, Src-Kinase, focal adhesion kinase) showed that phosphoinositol-3-kinase is the main intracellular pathway involved in non-uniform shear stress-induced mechanosignaling. These results, obtained in the well characterized in vitro model which allows in situ observation of bifurcation arteries, demonstrate the importance of hemodynamic forces on functional response in endothelial cells. Clarification of the cellular mechanisms underlying endothelial dysfunction in early atherogenesis and interfering with the inflammatory pathways induced by non-uniform shear stress will help to recognize novel targets for clinical interventions in atherosclerosis