Organic Anion Transporting Polypeptides (OATPs): Expression and localization in non-malignant and malignant breast tissue and their relevance for drug-drug interactions

Damit ein Arzneistoff in eine Zelle gelangen und dort seine Wirkung entfalten bzw. verstoffwechselt werden kann, muss er eine Plasmamembran passieren. Verschiedene Untersuchungen in den letzten Jahren belegten, dass diese Membranpassage in entscheidendem Maße von Transportproteinen vermittelt wird. Um die Bedeutung dieser Transportproteine besser zu erfassen, werden Studien zur Expression, Lokalisation und Funktion dieser Transporter durchgeführt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Mitglieder der Organic Anion Transporting Polypetide- (OATP) Familie untersucht. Gegenstand dieser Dissertation war es zum einen, Erkenntnisse über die Expression, Lokalisation und Funktion der in gesundem Brustgewebe und in Brustkrebsgewebe vorkommenden OATPs zu erlangen. Da sowohl Estrogenkonjugate als auch Zytostatika als Substrate für OATPs beschrieben wurden, ist eine Bedeutung dieser Transportproteine sowohl für die Tumorprogression als auch für das Therapieansprechen denkbar. Bei der Bestimmung der Expression der OATP-Familienmitglieder zeigte sich, dass in gesundem Brustgewebe und in Tumorgewebe OATP2B1, OATP3A1 und OATP5A1 am höchsten exprimiert sind, wobei sich kein signifikanter Unterschied in der mRNA-Menge zwischen gesundem Brustgewebe und Brustkrebsgewebe zeigte. Immunhistochemische Untersuchungen und Immunfluoreszenzanalysen ergaben eine Lokalisation dieser drei Transportproteine in der Plasmamembran der Epithelzellen der Drüsengänge und der Lobuli in gesundem Brustgewebe und im Zytoplasma und in der Plasmamembran der Brustkrebszellen. Weiterhin wurden funktionelle Analysen durchgeführt. Es konnte jedoch in keinem Fall eine signifikant vermehrte Aufnahme in die Zellen, die entweder OATP3A1 oder OATP5A1 stabil überexprimieren, im Vergleich zu den Vektorkontrollzellen gefunden werden. Diese Untersuchungen zeigen, dass OATPs eine wichtige Rolle bei der Pharmakotherapie des Mammakarzinoms spielen könnten. Die genaue physiologische Rolle dieser OATPs inklusive des Substratspektrums muss aber in weiteren Studien aufgeklärt werden. Des Weiteren wurde der Einfluss von drei Tamoxifenmetaboliten auf die Funktion der in der Leber exprimierten OATP-Familienmitglieder OATP1B1 und OATP1B3 untersucht. Die drei wichtigsten Metabolite des Tamoxifens sind N-Desmethyltamoxifen, 4-Hydroxytamoxifen und N-Desmethyl-4-hydroxytamoxifen (Endoxifen). 4-Hydroxytamoxifen und N-Desmethyl-4-hydroxytamoxifen sind dabei 100-fach wirksamer als die Muttersubstanz. Nachdem die Metabolite in der Leber gebildet worden sind, gelangen sie über die systemische Blutzirkulation an ihren Wirkort und von dort aus wieder in die Leber. Da diese Metabolite Auswirkungen auf die Aufnahme anderer, gleichzeitig verabreichter Arzneistoffe haben könnten, wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss der drei genannten Tamoxifenmetabolite auf den OATP1B1- und OATP1B3-vermittelten Pravastatin-Transport untersucht. Für alle drei Tamoxifenmetabolite fand sich eine signifikante Inhibition des OATP1B1- und OATP1B3-vermittelten Pravastatin-Transports. Allerdings konnte für keinen der Tamoxifenmetabolite ein signifikanter Transport über diese hepatischen Transportproteine bestimmt werden. Bei der Behandlung mit Tamoxifen kann es daher bei gleichzeitiger Gabe von Arzneistoffen, die Substrate für OATP1B1 oder OATP1B3 sind, zu Interaktionen kommen. Arzneimittelinteraktionen standen auch im Mittelpunkt im nächsten Abschnitt dieser Arbeit. Dabei wurde der Einfluss verschiedener nichtsteroidaler Antiphlogistika (NSAIDs) und von Paracetamol auf den OATP1B1- und OATP1B3-vermittelten BSP- und Pravastatin-Transport untersucht. In einem Vorversuch wurde der Einfluss von Acetylsalicylsäure, Diclofenac, Ibuprofen, Lumiracoxib, Naproxen, Paracetamol und Salicylsäure auf den OATP1B1- und OATP1B3-vermittelten BSP-Transport untersucht mit dem Ergebnis, dass Diclofenac, Ibuprofen und Lumiracoxib die Aufnahme von BSP signifikant inhibieren. Dieser Versuch wurde auch mit Pravastatin als Transportsubstrat durchgeführt. Hierbei zeigte sich für Diclofenac, Ibuprofen und Lumiracoxib interessanterweise keine Hemmung, sondern eine Stimulation des Pravastatin-Transports. Diese Effekte wurden durch kinetische Transportanalysen genauer untersucht. Die Auswertung der kinetischen Parameter ergab, dass es sich um eine allosterische Modulation der Pravastatin-Aufnahme handelt. Keines der untersuchten NSAIDs konnte als Transportsubstrat identifiziert werden. Nur für Diclofenac konnte eine signifikant erhöhte Aufnahme in HEK293-OATP1B3-Zellen im Vergleich mit den HEK293-Vektorkontrollzellen gefunden werden. Die klinischen Konsequenzen einer Stimulation des Pravastatin-Transports insbesondere durch Ibuprofen sind schwierig abzuschätzen. Insgesamt belegen diese in vitro-Arbeiten die Bedeutung von Transportproteinen der OATP-Familie für die Aufnahme von Arzneistoffen und für Arzneimittelinteraktionen.The uptake of drugs into cells is a prerequisite for intracellular drug action and metabolism. In recent years uptake transporters are recognized to play an important role for the distribution and elimination of drugs. In the focus of this thesis were members of the organic anion transporting polypeptide (OATP) family. In the first part of this thesis the expression, localization and function of OATPs in normal breast tissue and breast cancer tissue were investigated. Since estrogens and chemotherapeutic agents are known to be substrates of several OATPs, it is possible that OATPs contribute to tumor progression or to the development of resistance against chemotherapeutic agents. The evaluation of the mRNA amount of human OATP family members demonstrated that OATP2B1, OATP3A1 and OATP5A1 are highly expressed in normal breast tissue and breast cancer tissue. No significant differences in the mRNA amount between normal and malignant tissue but a high interindividual variability could be detected. Furthermore, localization of OATP3A1 and OATP5A1 to the plasma membrane of epithelial cells of the lactiferous ducts in normal breast tissue could be shown. In breast cancer tissue, both OATPs are highly expressed in the plasma membrane and in the cytoplasm. In addititon, functional analysis of OATP3A1 and OATP5A1 was performed, but none of the tested compounds showed a significantly increased accumulation in HEK293-OATP3A1 or HEK293-OATP5A1 cells compared to the respective HEK293-vector control cells. These results are important for further studies on the molecular action of hormones, which promote tumor growth, and may be relevant for cancer treatment using anticancer agents, which are substrates for these uptake transporters. Futhermore, the impact of the three tamoxifen metabolites N-desmethyltamoxifen, 4-hydroxytamoxifen and N-desmethyl-4-hydroxytamoxifen on the OATP1B1- and OATP1B3-mediated pravastatin transport was investigated. OATP1B1 and OATP1B3 are located in the basolateral membrane of human hepatocytes. Tamoxifen is a prodrug and is metabolized in the liver into the active metabolites 4-hydroxytamoxifen and N-desmethyl-4-hydroxytamoxifen. After being released into plasma and their action at the target tissue these metabolites reach in part the liver again. The presented data show that the investigated tamoxifen metabolites inhibited the OATP1B1- and OATP1B3-mediated pravastatin transport, but were not transported in a significant amount via these two liver-specific transporters. Therefore, pharmacokinetics of a simultaneously administered drug could be altered by tamoxifen metabolites. The interaction of NSAIDs and of paracetamol with OATP1B1 and OATP1B3 using the standard substrate BSP and the drug substrate pravastatin was studied in a further part of this thesis. The results demonstrated that BSP uptake was inhibited by diclofenac, ibuprofen and lumiracoxib. Interestingly, pravastatin uptake was stimulated by these NSAIDs. Kinetic analysis revealed that the kinetic constant Km and the maximal transport velocity Vmax were altered by adding ibuprofen, diclofenac or lumiracoxib. These NSAIDs were not transported by OATP1B1 and OATP1B3. Only diclofenac showed a significantly increased accumulation into HEK293-OATP1B3 cells in comparison to the respective HEK293-vector control cells. This suggests that these NSAIDs bind to an allosteric interaction site modulating the transport kinetics for OATP1B1- and OATP1B3-mediated transport by an allosteric mechanism without being transported itself. The clinical consequences of such stimulatory effects are difficult to predict. Stimulation of hepatocellular pravastatin uptake could have a benefit due to higher intracellular pravastatin concentrations and therefore to a more pronounced inhibition of the target enzyme HMG-CoA-reductase. These results demonstrated that beside competitive uptake inhibition other kinetic mechanisms may play a role in transporter-mediated drug-drug interactions. Taken together these in vitro-studies show the importance of OATPs for drug-drug interactions and indicate that these transporters may play a role for local concentrations of chemotherapeutic agents in the tumor