Characterization of the senescence-associated E3 ubiquitin ligase SAUL1 from Arabidopsis thaliana

Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Untersuchung der PUB-E3-Ubiquitinligase SAUL1 (senescence-associated E3 ubiquitin ligase 1, auch PUB44) aus Arabidopsis thaliana. Hierbei handelt es sich um eine Komponente des Ubiquitin-26S-Proteasom-Systems (UPS). SAUL1 dient als negativer Regulator von Seneszenzprozessen und verhindert ein verfrühtes Auftreten von Seneszenzsymptomen. Pflanzen der T-DNA-Insertionslinien saul1-1 und saul1-2 zeigen unter bestimmten Lichtbedingungen bereits im frühen Keimlingsalter eine Gelbfärbung der Blätter und es kommt zum Absterben der Pflanzen. Diese Seneszenzsymptome gehen mit einem Anstieg des endogenen Gehalts des Phytohormons Abszisinsäure (ABA) einher, das neben Entwicklungsprozessen vor allem an Reaktionen auf Stressbedingungen beteiligt ist. Darüber hinaus kommt es in seneszenten saul1-Pflanzen zu einer Zunahme der Protein- und Aktivitätslevel der Aldehyd-Oxidase AAO3, die den letzten Schritt der ABA-Biosynthese vermittelt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein direkter Zusammenhang zwischen SAUL1, der ABA-Biosynthese und dem pflanzlichen Seneszenzprogramm hergestellt werden. In saul1-Mutanten kam es unter niedrigen Lichtintensitäten zu einer Ausbildung von Seneszenzsymptomen, die stets mit einem Anstieg an AAO3-Proteinleveln und der zugehörigen enzymatischen Aktivität AOδ einhergingen. Durch Komplementation durch ein P35S:SAUL1-Konstrukt konnten sowohl der Seneszenzphänotyp als auch der Anstieg an AAO3-Protein verhindert werden. In einem Label-Transfer-Experiment konnte gezeigt werden, dass SAUL1 direkt mit AAO3 interagiert und dieses vermutlich zum Proteinabbau über das 26S-Proteasom markiert. Somit ist SAUL1 direkt an der Regulation des endogenen ABA-Gehalts unter niedrigen Lichtintensitäten beteiligt. In saul1-Mutanten kann dieses regulierende Eingreifen nicht mehr stattfinden und es kommt zum Anstieg des endogenen ABA-Levels und dadurch zu einem Auslösen des Seneszenzprogramms. In saul1-1abi1-1-Doppelmutanten, die neben der Mutation in SAUL1 eine gestörte ABA-Signaltransduktion aufwiesen, konnte eine fast vollständige Aufhebung der Seneszenzsymptome beobachtet werden. Es wurden physiologische Untersuchungen wie Keimungsstudien, Trockenstressexperimente oder auch Wachstumsstudien unter Salz- und osmotischen Stressbedingungen durchgeführt. In all diesen Untersuchungen konnte für saul1-Pflanzen ein ABA-hypersensitives Stressverhalten nachgewiesen werden, was vermutlich auf eine überschießende ABA-Biosynthese zurückzuführen war. Die Eigenschaft von saul1-Pflanzen als induzierbares Seneszenzsystem wurde in Expressionsstudien genutzt, um erste Schritte des pflanzlichen Seneszenzprogramms aufzuschlüsseln. In einem pulse-chase-Experiment konnte gezeigt werden, dass eine Anhäufung von ORE1-Transkript, dem eine wichtige Rolle als molekularer Schalter in pflanzlichen Seneszenzprozessen zukommt, den point-of-no-return im Seneszenzprozess von saul1-Pflanzen festlegt. Die Anhäufung von ORE1 stellte allerdings nicht die frühesten Veränderungen auf Transkriptebene dar. In Microarray-Analysen konnten bereits sechs Stunden nach Induktion des Seneszenzprogramms in saul1-Mutanten Veränderungen der Transkriptlevel der Seneszenz-assoziierten Transkriptionsfaktoren WRKY53, WRKY6 und AtNAP nachgewiesen werden. Dieser Anstieg der Transkriptlevel lag dabei zeitlich vor einer Anhäufung von ORE1, was auf eine übergeordnete Rolle dieser Transkriptionsfaktoren sowie SAUL1 innerhalb des Seneszenzsignalweges hindeutet. Im Vorfeld dieser Arbeit wurden in Yeast-Two-Hybrid-Studien verschiedene putative Interaktionspartner von SAUL1 identifiziert. In pulldown-Experimenten konnte allerdings für keines der untersuchten Proteine eine Wechselwirkung mit SAUL1 nachgewiesen werden. Ein ganz wesentlicher Punkt dieser Arbeit bestand in der Untersuchung der subzellulären Lokalisierung von SAUL1. Durch transiente Expression von SAUL1-GFP- und SAUL1-YFP-Fusionsproteinen sowie in Westernblot-Analysen konnte eine Assoziation von SAUL1 mit der Plasmamembran (PM) nachgewiesen werden. In Deletionsanalysen konnte eine C-terminale Domäne charakterisiert werden, die aus fünf hintereinander liegenden Armadillo (ARM)-Wiederholungen besteht. Diese fünf ARM-Wiederholungen sind notwendig und ausreichend, um eine Assoziation von SAUL1 mit der PM zu vermitteln. Dabei werden alle fünf ARM-Wiederholungen benötigt, um eine Interaktionsdomäne auszubilden, die durch Wechselwirkung mit einem noch unbekannten Membranprotein SAUL1 an der PM verankert. Auch für PUB43, der zu SAUL1 nächst-homologen PUB-E3-Ligase, konnte eine solche Interaktionsdomäne charakterisiert werden, die die Assoziation von PUB43 mit der PM vermittelt. SAUL1 spielt somit eine entscheidende Rolle bei der Modifizierung von Zielproteinen an der PM und hat damit unmittelbaren Einfluss auf frühe Signaltransduktionsereignisse in Seneszenzprozessen in Arabidopsis thaliana.The aim of this work was the characterization of the PUB-E3-ubiquitin ligase SAUL1 (senescence-associated E3 ubiquitin ligase 1, also known as PUB44) from Arabidopsis thaliana. SAUL1 is part of the ubiquitin-26S-proteasome system (UPS) mediating the transfer of ubiquitin moieties to target proteins and therefore marking these proteins for degradation via the 26S proteasome. SAUL1 functions as a negative regulator of senescence processes and prevents plants from premature senescence. The T-DNA insertion lines saul1-1 and saul1-2 display a yellowing of leaves in young seedlings under certain light conditions leading to the death of the plants. Senescence symptoms coincide with an increase in endogenous levels of the phytohormone abscisic acid (ABA), which is involved in the regulation of various developmental processes as well as stress responses. In addition to the increased ABA content, the levels of AAO3 protein and activity were elevated. AAO3 is mediating the very last step in ABA biosynthesis by converting abscisic aldehyde into abscisic acid. In this work, a direct connection between SAUL1, ABA biosynthesis, and the regulation of senescence processes in plants is demonstrated. When grown under low light conditions, saul1 plants displayed premature senescence symptoms accompanied by an increase in AAO3 protein content and the resulting enzymatic activity AOδ. Complementation of saul1 with P35S:SAUL1 abolished the senescence phenotype and the alterations in AAO3 protein levels completely. Direct interactions between SAUL1 and AAO3 protein occurred in label transfer experiments suggesting a possible role of SAUL1 in protein degradation of AAO3 via the 26S proteasome. Therefore SAUL1 seems to be involved in the regulation of ABA biosynthesis under low light conditions. This regulatory effect can no longer take place in saul1 mutants resulting in overaccumulation of ABA. These elevated endogenous ABA levels lead to the onset of senescence in saul1 plants. The introduction of a mutation in ABI1 coding for an essential component of the ABA-dependent signal transduction pathway led to a reduction of senescence symptoms in saul1-1abi1-1 double mutants compared to saul1-1 mutant plants. Additional physiological experiments such as germination assays or growth tests under drought stress, high salinity or osmotic stress conditions were performed. saul1 Plants showed ABA hypersensitive responses in all of the tests presumably due to an overshooting ABA biosynthesis. These results suggested an additional role for SAUL1 in the regulation of plant responses to various stress conditions by regulation of ABA biosynthesis. Gene expression studies were performed using saul1 plants as an inducible model system to study the onset and progression of senescence. Pulse-chase experiments demonstrated that the accumulation of ORE1 is involved in setting the point of no return in saul1 senescence. However, ORE1 accumulation is not the earliest response in the senescence program. Microarray analyses showed a significant increase in transcript levels of the senescence associated transcription factor genes WRKY53, WRKY6, and AtNAP starting 6 h after induction of senescence in saul1 mutants. These alterations occurred long before the accumulation of ORE1 suggesting that these transcription factors as well as SAUL1 may function upstream of ORE1. In previous yeast-two-hybrid assays putative interaction partners of SAUL1 have been identified. The aim of this work was to confirm these possible interactions. However, in pulldown assays no interaction between SAUL1 and the putative target proteins was detected. The last aim of this work was the subcellular localization of SAUL1. Transient expression of SAUL1-GFP and SAUL1-YFP fusion proteins as well as Western blot analyses showed an association of SAUL1 with the plasma membrane. However, SAUL1 itself lacks signals mediating a localization at the plasma membrane. Deletion analyses using truncated SAUL1 proteins identified a novel C-terminal domain which consists of five tandem oriented armadillo (ARM) repeats. These five ARM repeats are essential and sufficient to mediate an association of SAUL1 with the plasma membrane. All five ARM repeats together are necessary to form a protein-protein interacting domain anchoring SAUL1 at the plasma membrane most probably by interacting with an unknown membrane protein. A similar domain has been identified in PUB43 which is the closest homolog to SAUL1 and also localized at the plasma membrane. Taken together SAUL1 plays an important role in the modification of target proteins at the plasma membrane regulating the onset and progression of senescence processes in Arabidopsis thaliana