Functional analyses of the cytosolic Hsp70-Hsp40-chaperone system in Arabidopsis thaliana

Hitzeschockproteine (Hsp) der hoch konservierten Hsp70- und Hsp40-Familien besitzen als molekulare Chaperone in einem gemeinsamen Komplex eine entscheidende Rolle bei der Faltung von Proteinen in vielen Organismen. Die vorliegende Untersuchung des cytosolischen Hsp70-Hsp40-Systems in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana erfolgte ausgehend von der Wechselwirkung von Potyvirus-Kapsidproteinen und pflanzlichen Hsp40-Kandidaten. Die Interaktion der Tabak- und Arabidopsis-Hsp40-Proteine NtCPIP1, NtCPIP2a und AtDjB23 mit dem Kapsidprotein des Kartoffelvirus Y (PVY) war zuvor über Hefe-Zwei-Hybrid-Analysen identifiziert und unter anderem durch in vitro-Protein-Bindungs-Studien bestätigt worden. Über Expression von GFP-Fusionsproteinen dieser Hsp40-Proteine wurde ihre intrazelluläre Lokalisation als cytosolisch und nukleär bestimmt. Gleiches gilt für die Viruskapsidproteine von PVY und Rübenmosaikvirus (TuMV), was eine Voraussetzung für eine in vivo-Interaktion darstellt. In Abhängigkeit von Infektionen mit PVY konnten keine Veränderungen der Lokalisationen beobachtet werden, jedoch zeigte sich bei starker Expression von AtDjB23-GFP-Fusionsproteinen ein Auftreten cytoskelettartiger Strukturen. Die Steigerung der PVY-Toleranz durch Expression von J-Domänen-deletierten Tabak-Hsp40-Formen konnte erfolgreich von Tabak- auf Kartoffelpflanzen übertragen werden, was die Bedeutung der Kapsid-Hsp40-Interaktion bestätigte. Schließlich führte ebenfalls die Expression des J-Domänen-deletierten Arabidopsis-Hsp40-Proteins AtDjB23 in Arabidopsis zu einer erhöhten TuMV-Toleranz. Die Expression homologer Hsp40-Varianten ohne J-Domäne erscheint somit vielversprechend, um in verschiedenen Pflanzen Virustoleranzen zu erzeugen. Demgegenüber führt der Ausfall von AtDjB23 und gleichzeitig der am nächsten verwandten Isoform nicht zu einer Veränderung der Sensitivität gegenüber dem Virus oder des Wachstums der Arabidopsis-Pflanzen. Selbiges traf für den Hsp70-Kofaktor AtCHIP zu, was in diesem Fall im Gegensatz zu den Hsp40-Proteinen nicht mit möglichen Redundanzen einer großen Genfamilie erklärt werden kann. Als weiteren Bestandteil des Chaperonsystems wurden die cytosolisch vorhergesagten Hsp70-Isoformen in Arabidopsis untersucht. Aufgrund der Homologie wurden AtHsp70-1 bis -5 der DnaK-Unterfamilie und AtHsp70-14 bis -16 der Hsp110/SSE-Unterfamilie zugeordnet. Die durchgeführten Analysen zeigten große Unterschiede aber auch Gemeinsamkeiten in Expressionsmustern und Lokalisationen bei Standard-, Hitze- und Virusbehandlungen. Besonders bemerkenswert war, dass die GFP-Fusionsproteine von AtHsp70-1 bis –5, -14 und –15 zwar unter Standardbedingungen, wie vorhergesagt, im Cytosol und Zellkern lokalisiert waren, jedoch bei Hitzestressbehandlung unterschiedliche reversible Verschiebungen der Lokalisation auftraten. Mit verschiedenen Ansätzen der reversen Genetik wurden Pflanzen untersucht, bei denen Hsp70-Isoformen überexprimiert oder herabreguliert wurden. Nach Überexpression sowohl der einzelnen Isoformen als auch der putativen ATPase-defizienten Form AtHsp70-2-K74M wurden weder bei Normal- noch Hitze- oder Virusbehandlung phänotypische Unterschiede zum Wildtyp beobachtet. Aus physiologischen Analysen von T-DNA-Insertionslinien wurden deutliche Hinweise auf funktionelle Redundanz der cytosolischen Mitglieder der DnaK-Unterfamilie gewonnen. Im Gegensatz dazu wurden beim Ausfall von Mitgliedern der Hsp110/SSE-Unterfamilie klar erkennbare Auffälligkeiten beobachtet. Transgene amiRNA-AtHsp70-14/15-Pflanzen, welche eine deutlich verringerte Transkriptmenge von AtHsp70-14 und –15 besitzen, sowie hsp70-15 Knockout-Pflanzen, nicht aber hsp70-14 oder hsp70-16 KO-Pflanzen, besaßen einen Phänotyp mit verringertem Wachstum, beschleunigtem Welken aufgrund geöffneter Stomata als auch geringerer Hitze- aber erhöhter Virustoleranz gegenüber TuMV. Eine Transkriptomanalyse der amiRNA-AtHsp70-14/15-Pflanzen zeigte eine konstitutive Hitzeantwort mit besonderer Ähnlichkeit zur „cytosolischen Proteinantwort“. Da dies auf eine Akkumulation missgefalteter Proteine und somit auf eine gestörte Chaperonfunktion hinweist, wurde unter Bezug auf die Homologie zu SSE1 ein Modell für eine Nukleotidaustausch-Funktion von AtHsp70-15 für die cytosolischen Mitglieder der DnaK-Unterfamilie aufgestellt. AtHsp70-15 scheint dementsprechend ein entscheidender Faktor für die Faltung cytosolischer Proteine zu sein.Heat shock proteins (Hsp) of the highly conserved Hsp70 and Hsp40 families play, as molecular chaperones in a joint complex, a crucial role for protein folding in many organisms. In the present thesis the cytosolic Hsp70-Hsp40 system in the model plant Arabidopsis thaliana was analysed, starting with the interplay between potyvirus capsid proteins and plant Hsp40 candidates. The interaction of tobacco and Arabidopsis Hsp40 proteins NtCPIP1, NtCPIP2a, and AtDjB23 with the potato virus Y (PVY) capsid protein has been identified before by a yeast two-hybrid screening and affirmed for example by in vitro pull-down analyses. The intracellular localization of these Hsp40 proteins was determined to be cytosolic and nuclear via expression of GFP fusion proteins. The same was shown for PVY and Turnip mosaic virus (TuMV) capsid proteins, which is a prerequisite for the in vivo interaction of the capsid proteins with Hsp40 proteins. PVY infection did not change the localization of AtDjB23-GFP fusion proteins but strong expression rates led to fluorescent structures reminiscent of cytoskeleton elements. The overexpression of J-domain deleted tobacco Hsp40 variants led in potato, as before in tobacco, to enhanced PVY resistance, which reinforced the importance of the capsid-hsp40 interaction. The same result could be achieved with the Arabidopsis homoloque AtDjB23 in Arabidopsis thaliana. Therefore, utilization of Hsp40 deletion variants missing the J-domain seems to be an efficient way to create virus-tolerant plants. In contrast, complete loss of AtDjB23 and its closely related isoform did not change sensitivity to potyviruses and had no effect on plant growth in Arabidopsis. The same results were obtained for the hsp70 cofactor AtCHIP, which in this case can not be explained by redundancy within a large gene family. As another part of the chaperone system, cytosolic predicted Hsp70 isoforms in Arabidopsis were analysed in detail. Due to sequence homology, AtHsp70-1 to -5 were grouped into the DnaK subfamily and AtHsp70-14 to –16 into the Hsp110/SSE subfamily. Large differences but also similarities were found in their expression patterns and localizations after standard, heat, or virus treatment. Notably, GFP-fusion proteins of AtHsp70-1 to –5, -14 and –15 were localized, as predicted, to cytosol and nucleus under normal conditions, but shifted reversibly to different localizations during heat treatment. In several reverse-genetic attempts, Hsp70 over-expressing or silenced plants were investigated. Overexpression of single isoforms or of a putative ATPase deficient variant, AtHsp70-2-K74M, did not show phenotypical changes compared to wild type under standard, heat, or virus treatment. Additionally, studies with T-DNA insertion lines strongly suggested a functional redundancy among the cytosolic members of the DnaK subfamily. In contrast, the loss of members of the Hsp110/SSE subfamily led to a mutant phenotype. Transgenic AtHsp70-14/15 silenced plants and hsp70-15 knock-out mutant plants exhibited reduced size, accelerated wilting due to opened stomata, enhanced heat sensitivity, and virus tolerance against TuMV, whereas hsp70-14 KO and hsp70-16 KO plants reflected wild type phenotype. Transcriptional analysis of AtHsp70-14/15 silenced plants showed a constitutive heat response, with special similarity to the “cytosolic protein response”, suggesting the accumulation of unfolded proteins and disturbed chaperone function. Hsp70-15 is thought to be, like its yeast homologue SSE1, a nucleotide exchange factor for the cytosolic Hsp70 isoforms of the DnaK subfamily. Therefore, AtHsp70-15 is likely to be a key factor for the proper folding of cytosolic proteins