Impact of protein folding on viral replication

Diese Arbeit befasste sich mit der Fragestellung, wie durch gezielte Modifikation der Proteinfaltung die virale Replikation beeinflusst werden kann. Durch Jahrmillionen der Koevolution entwickelten Viren eine Abhängigkeit von Mechanismen der Wirtszellen. Zelluläre Proteine stellen auf Grund ihrer geringen Mutationsrate interessante Ansatzpunkte zur antiviralen Therapie dar. So wurde für die Assemblierung, Knospung und Reifung diverser Retroviren eine Abhängigkeit gegenüber einem funktionalen Ubiquitin-Proteasom-System in den Zielzellen beschrieben. Diese Effekte wurden bisher allein auf die Proteasom-Inhibitor (PI)-bedingte Depletion des freien zellulären Ubiquitins zurückgeführt. Im ersten Schwerpunkt dieser Arbeit wurde gezeigt, dass ein auf dem chemischen Chaperon Glycerol basierendes Medium, welches Zellen optimierte Bedingungen zur Proteinfaltung bietet, die Prozesse der viralen Freisetzung positiv beeinflusst. Weiterhin war es möglich, den PI-bedingten Freisetzungsdefekt durch die Applikation des Glycerolmediums abzuschwächen. Dies liegt an der Verminderung der durch die Hemmung der Proteasom-Aktivität bedingten Akkumulation fehlgefalteter, polyubiquitinierter Gag-Moleküle, den sogenannten Gag-DRiPs, welche in einer mechanistisch den Prionen ähnlichen Art und Weise die Freisetzung viraler Partikel beeinflussen. Diese in den Replikationsstudien beobachteten Effekte traten in einer derart kurzen Zeitspanne auf, dass sie in starkem Kontrast zu der erst deutlich später detektierbaren Abnahme des freien Ubiquitins stehen. Aus diesen Daten geht hervor, dass die PI-bedingte Hemmung der viralen Freisetzung nicht allein auf einer verringerten zellulären Ubiquitinmenge beruhen kann, sondern vielmehr auch durch Gag-DRiPs bedingt wird. Ein weiterer Schwerpunkt lag in der spezifischen Hemmung des zentralen zellulären Hitzeschockproteins Hsp90 und deren Auswirkung auf die Replikation von HIV-1. Die selektive Hemmung von Faltungsprozessen führt zur Akkumulation polyubiquitinierter Proteine, welche wiederum mit der geordneten Assemblierung von Gag-Molekülen interferieren können. Sowohl in ex vivo kultivierten tonsillärem Gewebe als auch in PBMCs konnte eine deutlich dosisabhängige Hemmung der HIV-1 Replikation durch den Hsp90-Inhibitor 17-AAG nachgewiesen werden. Die hierbei verwendeten Substanzmengen lagen weit unter der maximal tolerierbaren Konzentration. Weiterhin zeigte die Kombination von 17-AAG mit einem PI (PS-341) im niedrigen nanomolaren Bereich synergistische Effekte auf die Hemmung der Replikation von HIV-1, was für einen günstigen therapeutischen Index in vivo spricht. Diese Ergebnisse charakterisieren die selektive Hemmung von Hsp90 durch 17-AAG in Kombination mit Proteasom-Inhibitoren als vielversprechenden therapeutischen Ansatz zur Einflussnahme auf die Replikation von HIV-1. Ein alternativer Mechanismus, wie ein korrekt gefaltetes virales Protein auf die Virusfreisetzung einwirkt, wurde in einem dritten Schwerpunkt aufgezeigt. Das elfte IAV-Protein PB1-F2 wurde auf dessen inhärente Fähigkeit zur Oligomerisierung untersucht. Durch Studien synthetischer Peptide zeigte sich, dass PB1-F2 Oligomere ausbildet, die durch chemische cross linker stabilisiert und nachgewiesen werden konnten. In Übereinstimmung mit in silico generierten Vorhersagen konnten der N- und C-terminale Bereich des Proteins als Oligomerisierungsdomänen charakterisiert werden. Unterstützt durch die Ausprägung von Disulfidbindungen über das Cystein in Position 42, befindet sich die Hauptoligomerisierungsdomäne im C-Terminus von PB1-F2. In Kombination mit dem Vorhandensein einer mitochondrialen Lokalisationssequenz wird deutlich, dass die PB1-F2 vermittelte Apoptose auf der Ausbildung von PB1-F2-Ionenkanälen beruht, was durch eine spätere Publikation unseres Labors bestätigt werden konnte. Folglich könnte PB1-F2, ähnlich wie das M2-Protein der Orthomyxoviridae und das Vpu-Protein der Retroviridae zu den Viroporinen gezählt werden und über Multimerisierung zur Ausbildung von Ionenkanälen in der mitochondrialen Membran zur Pathogenität des IAV beitragen.This study dealt with the influence on viral replication by a systematic modification of protein folding. During millions of years of co-evolution viruses generated a dependency on host cells mechanism. Cellular proteins are interesting starting points for antiviral therapy due to their marginal mutation rate. Therefore a dependency of retroviral assembly, budding, and maturation to a functional ubiquitin-proteasome system of target cells was described. These effects were led back to proteasome inhibitor (PI) caused depletion of free cellular ubiquitin so far. The first emphasis of this work was to demonstrate that a medium based on the chemical chaperone glycerol provides optimized conditions for protein folding, as well as affects the release of viral particles positively. Furthermore the PI-caused defect of virus release was attenuated by application of glycerol substituted medium. This is caused by the decrease of accumulated, misfolded, polyubiquitinated Gag-molecules followed by inhibition of proteasomal activity, so called Gag-DRiPs, which act in a prion-like manner to influence the release of viral particles. In replication studies these effects were detected in such a short period of time that they were in strong contrast to the decrease of free ubiquitin detectable broadly later. These data demonstrate that a PI-caused decrease of virus release is not only caused by a diminished quantity of cellular ubiquitin but through the influence of Gag-DRiPs. A further emphasis was the specific inhibition of the central cellular heat shock protein Hsp90 and the consequences on HIV-1 replication. The selective inhibition of folding processes results in the accumulation of polyubiquitinated proteins which may interfere with the well-regulated assembly of Gag-molecules. As well as in ex vivo cultivated tonsillary tissues as in PBMCs a clear concentration dependency of inhibition of HIV-1 replication was detectable by Hsp90 inhibitor 17-AAG. The applied amounts of the inhibitor were far below maximum tolerated concentration. In addition a combination of 17-AAG with a PI (PS-341) in low nanomolar concentrations demonstrated synergistic effects on inhibition of HIV-1 replication which indicates a beneficial therapeutic index in vivo. These results characterize the selective inhibition of Hsp90 by 17-AAG in combination with proteasome inhibitors as a promising therapeutic approach to influence HIV-1 replication. A third emphasis based on an alternative mechanism which pointed out how a correct folded viral protein is able to influence virus release. The 11th IAV-protein PB1-F2 was characterized concerning its inherent capability to oligomerize. By using synthetic proteins it was shown that PB1-F2 forms detectable oligomers which can be stabilized via a chemical cross linker. In accordance to in silico generated predictions the N- and C-terminus of PB1-F2 were characterized as domains of oligomerization. The main oligomerization domain of PB1-F2 is located in its C-terminus supported by the occurrence of disulfide bonds via the cysteine in position 42. This in combination with the existence of a mitochondrial localization sequence corroborates that the PB1-F2 mediated apoptosis is based on the formation of PB1-F2 ion channels. This fact was published by our laboratory recently. Accordingly to this PB1-F2 may be dedicated to the viroporins, as well as the M2-protein of orthomyxoviridae and the vpu-protein of retroviridae, and support pathogenicity of IAV by its multimerization and formation of ion channels into the mitochondrial membrane