Positional cloning of a new gene for syndromic mental retardation

Einleitung Das Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung eines neuen Gens für syndromale mentale Retardierung. Die Grundlage der Arbeit stellte dabei ein Patient mit mentaler Retardierung, epileptischen Anfällen, multizystisch dysplastischen Nieren, submuköser Gaumenspalte, Innenohrschwerhörigkeit und diversen facialen Dysmorphien dar. Eine hochauflösende Chromosomenanalyse in Kombination mit einem Subtelomerscreening ergab bei dem Patienten eine balancierte Translokation, der Karyotyp lautete 46,XY,t(11;20)(p15;q13.3). Die Kartierung der Bruchpunkte erfolgte zunächst mit FISH-, Mini-FISH- und Southern Blot-Analysen. In den so eingegrenzten Regionen wurden anschließend bruchpunktüberspannende Fragmente mittels PCR generiert und sequenziert, um den Bruchpunkt genau zu bestimmen. In einem weiteren Schritt wurde mittels RT- und Real-Time-PCR-Analysen die Expression von ST5 an lymphoblastoiden Zelllinien und an verschiedenen fetalen und adulten humanen Geweben untersucht. Um zu überprüfen, ob ST5 auch in der embryonalen Gehirnentwicklung eine Rolle spielen könnte, wurden Tissue-in-situ-Hybridisierungen an Mausembryonen verschiedener Embryonalstadien, sowie an Nieren- und Gehirngewebe neugeborener und adulter Tiere durchgeführt. Des Weiteren wurden 230 Patienten mit überlappendem Phänotyp auf Sequenzveränderungen im ST5-Gen untersucht. Ergebnisse und Beobachtungen Durch die FISH-, Mini-FISH- und Southern-Blot-Analysen konnte die Bruchpunktregion so stark eingegrenzt werden, dass ein bruchpunktüberspannendes Fragment generiert werden konnte. Durch Sequenzierung dieses Fragmentes wurde der Bruchpunkt auf beiden derivativen Chromosomen auf die Base genau bestimmt. Auf Chromosom 20 liegt im Bereich des Bruchpunktes kein bekanntes oder vorhergesagtes Gen. Der Bruchpunkt auf Chromosom 11 hingegen liegt in der 5'-UTR des ST5-Gens und trennt die nicht-kodierenden von den kodierenden Exons. Die RT-PCR und Real-Time-PCR Analysen zeigten, dass ST5 in lymphoblastoiden Zelllinien nicht exprimiert wird. Da vom Translokationspatienten nur eine aus einer lymphoblastioden Zelllinie gewonnene RNA für die Analyse zur Verfügung stand, war ein Nachweis der Haploinsuffienzienz nicht möglich. Des Weiteren konnte durch die Real-Time-PCR eine ubiquitäre Expression des ST5-Gens in humanem fetalen Gewebe, insbesondere eine starke Expression in der Niere nachgewiesen werden. Die Real-Time-PCR Analyse an adultem humanen Gewebe zeigte eine sehr starke ST5-Expression in Gehirn, Niere und Skelettmuskel, während die Expression in allen übrigen Geweben unter der von den fetalen Geweben lag. Durch die Maus-in-situ-Hybridisierungen konnte gezeigt werden, dass St5 erst in den späteren Embryonalstadien exprimiert wird, dann im frontalen Cortex, in der Niere und im Gaumen der Embryonen. Die Expression im frontalen Cortex beschränkt sich dabei auf die Ventrikulär- und Marginalzone. Bei neugeborenen Mäusen waren spezifische St5-Signale in den sich entwickelnden tubulären Strukturen der Niere nachweisbar. Bei wenige Tage alten und adulten Tieren wurden Signale im gesamten Cortex, sowie in der hippocampalen Region und im Kleinhirn gefunden. Im Mutationsscreening fanden sich nur Veränderungen, die auch bei den gesunden Eltern oder Geschwistern der untersuchten Patienten nachweisbar waren und somit als Polymorphismen gewertet werden. Praktische Schlussfolgerungen Durch die Bestimmung der Bruchpunkte der Translokation t(11;20)(p15;q13.3) konnte ST5 als Kandidatengen für eine neue Form der syndromalen mentalen Retardierung identifiziert werden. Die Beobachtungen aus der Maus-in-situ-Hybridisierung legen nahe, dass ST5 eine Rolle während der Gehirnentwicklung, insbesondere bei der Bildung der verschiedenen Schichten des Cortex und der Migration der Neuronen zu spielen scheint. Defekte im ST5-Gen könnten eine Migrationsstörung der Neuronen hervorrufen, die in einer mentalen Retardierung oder Epilepsie resultieren. Diese Effekte ließen sich durch die mögliche regulatorische Funktion des ST5-Gens an der MAPK/ERK2-Signalkaskade erklären. Durch diesen Signalweg werden Zellwachstum, Zelldifferenzierung und Zellteilung sowie die Organisation des Zytoskeletts beeinflusst. Auch die Gaumenspalte und die Nierenfehlbildung könnten durch die Fehlregulation dieser Signalkaskade erklärt werden. Für andere Proteine mit DENN-Domänen, wie sie im ST5-Gen enthalten sind, ist eine Beteiligung an der Vesikelbildung und ~freisetzung, insbesondere in Neuronen beschrieben. ST5 könnte demzufolge auch an der Neurotransmitterfreisetzung beteiligt sein und Defekte im ST5-Gen somit zu einer Störung der Signalübertragung führen. Ein solcher Mechanismus könnte ebenfalls in neurologischen Symptomen, aber auch in einer Innenohrschwerhörigkeit resultieren.Introduction The primary object of this study was the identification of a new gene for syndromic mental retardation. Investigations were based on a patient with developmental delay and mental retardation, seizures, cystic kidney dysplasia, bilateral sensorineural hearing loss, submucous cleft palate and several dysmorphic facial features. High resolution GTG-banding in conclusion with subtelomeric screening showed a balanced translocation, which was interpreted as 46,XY,t(11;20)(p15;q13.3). Positional cloning was performed using FISH-, mini-FISH and Southern-Blot techniques. In addition I was able to generate breakpoint-spanning fragments, which were sequenced for exactly genomic mapping of the breakpoints. Afterwards I analysed the expression of the identified candidate gene with RT- and Real-Time-PCR on lymphoblastoid cell lines as well as in several human fetal and adult tissue. In addition I have done tissue-in-situ-hybridization on mouse-embryos of different age and kidney and brain sections of newborn and adult mice. Furthermore I performed ST5 mutational analysis in a total of 230 patients with a comparable phenotype to the translocation-patient. Results FISH-, mini-FISH- and Southern-Blot analyses narrowed down the breakpoint region to fragments, usuable to generate breakpoint-spanning amplicons. These amplicons were sequenced and therefore it was possible to exactly map the breakpoint on both derivative chromosomes. The chromosomal break on chromosome 20 did not occur within any known or putative genes. In contrast the breakpoint on chromosome 11 was located within the 5-prime UTR region of the ST5-gene, separating the complete coding region from its promoter region. RT- and Real-Time-PCR analyses showed ST5 not expressed in lymphoblastoid cell lines. Because I only had patient material from LCL, it was not possible to investigate if disruption of ST5 results in haploinsufficiency. I also performed Real-Time-PCR on human fetal and adult tissues. I saw a relatively uniform expression pattern in fetal tissues. In contrast, expression in most adult tissues was lower than in the corresponding fetal tissues, except adult brain, kidney and skeletal muscle with 2.5 to 3 times higher expression levels compared to the respective fetal tissues. In addition I found increased expression of St5 during development using tissue-in-situ-hybridization on mouse-embryos of different age. St5 was expressed in the ventricular and the marginal zone of the frontal cortex of E15 embryos. In newborn mice St5 specific signals were also detectable in developing tubular structures of the kidney. In adult mice St5 was expressed in the cortex, the hippocampal regions and the cerebellum. ST5 mutational analysis only showed missense-mutations which alltogether were from parents inherited variants. Conclusions Through narrowing down the breakpoints of the translocation t(11;20)(p15;q13.3), ST5 was identified as a candidate gene for syndromic mental retardation. RNA-in-situ-hybridization in mouse suggest an important role for St5 during brain development, especially in formation of cortex layers and neuron migration. Thus defects in ST5 could lead to dysfunction of neuron migration and hence may result in mental retardation or seizures. These effects could be explained by the possible regulatory function of the ST5 gene in the MAPK/ERK2 signalling pathway. This pathway affects cell growth, cell differentiation and cell devision as well as cytoskeletal organization. The cleft palate and the kidney malformation could also be explained through regulation of these signalling pathway. Other proteins containing DENN-domains like ST5 are delineated to be involved in vesicle formation and release, particularly in neurons. Therefore ST5 may regulate neurotransmitter release and defects in this gene could result in disturbance of signal transmission. Hence this mechanism is supposed to lead to neuronal symptoms as well as to sensorineural hearing loss