The impact of polymorphism of the HIV-1 protease on the development of drug resistance

Die Einführung der Proteaseinhibitoren in die HIV-Therapie ermöglichte erstmals eine langandauernde Unterdrückung der Viruslast, wodurch die Morbidität und Mortalität HIV-infizierter Patienten drastisch gesenkt werden konnte. Der Erfolg der Therapie wird jedoch durch das Auftreten resistenzassoziierter Mutationen in Frage gestellt. Bei Therapie mit dem Proteaseinhibitor Nelfinavir (NFV) treten abhängig vom HIV-1 Subtyp unterschiedliche Mutationsmuster auf. Daher sollten in der vorliegenden Arbeit Subtyp-spezifische Mutationen identifiziert werden, die im Kontext der primären Resistenzmutationen 30N, 88D und 88S auftreten. Um prädisponierende Faktoren zur Entstehung von NFV-Resistenz zu definieren, sollten häufige Kombinationen von Mutationen auf Resistenz, Kreuzresistenz und Replikationskapazität untersucht werden. Hiermit sollten Zusammenhänge hinsichtlich Therapie und Subtyp aufgedeckt werden. Zunächst wurde in den öffentlich zugänglichen Datenbanken geno2pheno (http://www.genafor.org/) und HIV Drug Resistance Database der Stanford University (http://hivdb.stanford.edu/) nach Polymorphismen im Kontext der Mutation 30N gesucht. Diese Daten wurden mit dem HIV-1 Subtyp B und C sowie der NFV-Vorbehandlung korreliert. Mittels verschiedener Mutagenese-Verfahren wurden einzelne NFV-Resistenzmutationen und Kombinationen mit einzelnen Polymorphismen in einen proviralen HIV-1 Klon eingebracht. Das Replikationsverhalten und die Resistenz der rekombinanten Viren wurden untereinander und mit HIV-1 Wildtyp verglichen. Durch die Datenbankanalysen konnten neben den bekannten 30N-assoziierten Mutationen 36I, 63P, 71V, 77I und 93L weitere Polymorphismen identifiziert werden. Die Mutation 57K war gehäuft in Isolaten zu finden, die ausschließlich 30N als Primärmutation trugen, während 77I mit 30N im Kontext weiterer Primärmutationen in der HIV-1 Protease auftrat. Isolate der Subtypen B und C unterschieden sich signifikant in der Frequenz der Polymorphismen: so wurde die Mutation 77I vor und nach NFV-Therapie signifikant häufiger in Subtyp B als in Subtyp C gefunden. Mittels in vitro Mutagenese konnten insgesamt 10 virale Klone generiert werden (30N, 30N+57K, 30N+77I, 88D, 88D+57K, 88D+63P, 88D+77I, 88S, 88S+63P, 63P). Rekombinante Viren mit 30N wiesen eine stark erniedrigte Replikationskapazität auf. Durch die zusätzliche Mutation 77I nahm nicht nur die Replikationskapazität, sondern auch die NFV-Resistenz deutlich zu. Ähnliche Effekte waren für 77I bzw. 63P auch im Kontext der Mutationen 88D/S zu beobachten. Schließlich konnten anhand der Klone bislang nicht bekannte Hyersuszeptibilitäten für andere Proteaseinhibitoren identifiziert werden. Die Subtyp-spezifischen Polymorphismen erklären, warum in Subtyp B-Isolaten unter NFV signifikant häufiger die Mutation 30N selektioniert wird als in Subtyp C-Viren. Damit wird die Resistenzentwicklung entscheidend von der genetischen Ausstattung der HI-Viren beeinflußt. Die Mutagenese lieferte neue Erkenntnisse über die Replikationskapazität und Kreuzresistenz NFV-resistenter Viren, was beim Therapiewechsel die Auswahl des nächsten Proteaseinhibitors erleichtert.The introduction of HIV-1 protease inhibitors into antiretroviral therapy allowed, for the first time, a long-lasting suppression of the viral replication, which drastically reduced the morbidity and mortality of HIV-1 infected patients. The therapeutic success, however, has been compromised by the emergence of drug resistant viruses. In patients treated with the protease inhibitor nelfinavir (NFV), different mutational patterns occur depending on the HIV-1 subtype. In this M.D. thesis, we aimed to identify subtype-specific mutations which occur in the context of the primary resistance mutations 30N, 88D and 88S. To define predisposing factors for the development of NFV resistance, we wanted to investigate frequent combinations of mutations with respect to resistance, cross-resistance and replication capacity. These data should help uncover the connection between subtype and therapy. First, the publicly accessible databases geno2pheno (http://www.genafor.org/) and the HIV Drug Resistance Database of the Stanford University (http://hivdb.stanford.edu/) were searched for polymorphisms in the context of the 30N mutation. These data were correlated with the HIV-1 subtypes B and C as well as pretreatment with NFV. Second, single mutations and combinations of mutations were introduced into a proviral HIV-1 clone using different technical approaches for mutagenesis. The replication capacity and resistance of these recombinant viruses were compared with each other and HIV-1 wildtype. The database analyses identified new polymorphisms in addition to the known 30N-associated mutations 36I, 63P, 71V, 77I, and 93L. The mutation 57K was frequently detected in viruses which harbored only 30N as primary resistance mutation, whereas 77I was detected with 30N in the context of other primary resistance mutations. Subtype B and C isolates significantly differed in the frequency of the polymorphisms: in this respect, mutation 77I was found in subtype B significantly more frequent than in subtype C prior to and after NFV therapy. Using in vitro mutagenesis, a total of 10 viral clones were generated (30N, 30N+57K, 30N+77I, 88D, 88D+57K, 88D+63P, 88D+77I, 88S, 88S+63P, 63P). Recombinant viruses harboring 30N were severely impaired in their replication capacity. The additional mutation 77I not only restored the replication capacity, but also increased NFV resistance. Similar effects were observed for 77I and 63P in the context of the mutations 88D/S. Finally, these clones were used to identify hypersusceptibilities for other protease inhibitors which were not known to date. The subtype-specific polymorphisms explain why subtype B viruses select for 30N more frequently than subtype C isolates. These data indicate that the development of drug resistance is crucially affected by the genetic make-up of the viruses. The mutagenesis provided new findings on the replication capacity and cross-resistance of NFV-resistant viruses, which will facilitate the choice of the protease inhibitor in subsequent therapeutic regimen