The Role of intracellular Calcium in a Modell of Costimulation via CD 28 on Jurkat-Cells

1) Hintergrund und Ziele Ein entscheidender Schritt einer effektiven Immunabwehr besteht in der Aktivierung von Antigen-spezifischen T-Zellen. Dabei ist nicht nur das Antigen selbst als Signal, sondern auch ein zweites Signal erforderlich. Darauf beruht die sogennante Zwei-Signale-Hypothese der Kostimulation. Das in diesem Zusammenhang am Besten untersuchte Signalmolekül ist CD28, dessen Stimulation neben der Aktivierung von anderen, bereits gut untersuchten Signaltransduktionswege auch eine Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration bewirkt. Ziel dieser Arbeit ist, diesen Mechanismus ebenso wie seine Bedeutung bei der Aktivierung von T-Lymphozyten zu untersuchen. 2) Material und Methoden Für diese Arbeit wurden native Jurkat-Zellen mit Zelllinien verglichen, die entweder mit dem Wildtyp des murinen CD 28 transfiziert worden waren, oder mit unterschiedlichen Mutationen von diesem, welche abgewandelte intrazelluläre Domänen aufweisen, bis hin zu einem Konstrukt ganz ohne intrazelluläre Domänen. Als Kontrolle wurde zunächst die Expression von humanem und murinem CD28 auf der Oberfläche untersucht. Die Messung der Interleukin-2-Produktion nach Stimulation mit PMA/IoM und Antikörpern gegen humanes bzw. gegen murines CD28 dient zum Nachweis der Spezifität und der Funktionalität der transfizierten Moleküle. Mittels Fluoreszenz-Messung wurde die Veränderung der intrazellulären Kalziumkonzentration nach Zugabe von Antikörpern gegen humanes bzw. murines CD28 beobachtet. 3) Ergebnisse und Beobachtungen Auf den transfizierten Zelllinien ließ sich murines CD28 nachweisen. Nach Stimulation mit anti-huCD28 reagierten alle Zelllinien mit einer deutlichen Steigerung der IL-2-Produktion, nach Zugabe von anti-mCD28 kam es nur bei den mit Wildtyp-mCD28 transfizierten Zellen zu einem Anstieg der IL-2-Produktion. Die Stimulation mit Antikörpern gegen humanes CD28 führte auf allen Zellen zu einem Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration. Nach Stimulation mit Antikörpern gegen murines CD28 dagegen zeigten nicht nur die untransfizierten Zelllinien, sondern auch alle mit murinem CD28 transfizierten Zelllinien keine Veränderung der intrazellulären Kalziumkonzentration. 4) Schlussfolgerungen Auf den humanen Jurkat T-Zellen führt die Aktivierung des transfizierten murinen CD28 nicht zu Kalzium-Einstrom, aber sie steigert die Interleukin-2-Produktion ebenso wie die Stimulation des humanen CD28-Moleküls. Das bedeutet, dass die Interleukin-2-Produktion unabhängig von CD28-vermitteltem Kalziumeinstrom ist.1) Background and objectives A crucial part of an effective immunological defense is activation of antigen-specific-T-cells. According to the two-signal-hypothesis of costimulation, this requires not only the antigen itself, but also a second signal. The best known signalling molecule in costimulation is CD28 which stimulated leads to an elevation of intracellular calcium concentration. The mechanisms that lead to this increase is not known. The aim of this work has been to elucidate the mechanism that leads to this increase as well as its meaning in the activation of T-lymphocytes. 2) Materials and methods For this work, native Jurkat-cells were compared to cell lines transfected with either the wildtype or with different mutations of murine CD28, including a conctruct completely without intracellular domains. After control of the expression of human or murine CD28, respectively, the determination of IL-2-production after stimulation with PMA/IoM and mAbs against human or murine CD28 was used to prove specifity and functionality of the transfected molecules. The change of intracellular calcium concentration after incubation with mAbs against human and murine CD28 was observed by measurement of fluorescence. 3) Results Murine CD28 could be detected on the transfected cells. All different cell lines responded with a significant increase of IL-2-production after stimulation with anti-humanCD28. After incubation with anti-murineCD28, only the wildtype-mCD28-transfected cells produced more IL-2. Stimulation with mAbs against human CD28 lead to higher intracellular calcium levels, whereas stimulation with mAbs against murine CD28 not only the non-transfected cells, but also all cells transfected with murine CD28 showed no response. 4) Conclusions The stimulation of the transfected murine CD28 molecule in the human Jurkat T-cells does not lead to a change of the intracellular concentration of calcium, but activates interleukin-2-production comparable to the stimulation of the human CD28. Therefore, interleukin-2-production must be independent of CD28-mediated calcium-influx