Aβ-peptide and tau-phosphorylation patterns related to the distribution and activation of extracellular regulated kinase ERK 1/2 in post mortem brain tissue of Alzheimer´s patients

Hintergrund und Ziele Die Alzheimer-Erkrankung ist die häufigste Form der senilen Demenzen. Sie ist gekennzeichnet durch fortschreitende Einbußen höherer Hirnleistungen. Die beiden zugrundeliegenden neuropathologischen Veränderungen sind extrazellulär gelegene Plaques aus aggregierten Aβ-Peptiden, sowie intrazelluläre neurofibrilläre Bündel, bestehend aus hyperphosphoryliertem Tau-Protein. Letzteres verliert dadurch seine Bindung an Mikrotubuli. Dies hat den Zusammenbruch des intrazellulären Transports und somit neuronale Degeneration zur Folge. Für diese übermäßige Phosphorylierung scheint ein Ungleichgewicht der beteiligten Tau-Proteinkinasen und -phosphatasen verantwortlich zu sein. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden post mortem Gehirnproben von Alzheimer-Patienten und altersentsprechend gesunden Kontrollprobanden analysiert. Die Proben stammten dabei aus drei verschiedenen Gehirnarealen, nämlich aus dem temporalen und dem frontalen Cortex, sowie aus dem Cerebellum. Untersucht wurde die Verteilung von Aβ-Peptiden, der Phosphorylierungsgrad des Tau-Proteins, sowie die Phosphorylierungs- und somit Aktivitätsrate der extrazellulär-regulierten Kinase ERK1/2, einer Tau-Kinase, in den verschiedenen Gehirnregionen. So sollte der mögliche Einfluss dieser Proteinkinase auf die Entstehung der Alzheimer-Demenz demonstriert werden. Methoden Die Präparation des Gehirngewebes erfolgte unter Kühlung, um eine vorzeitige Dephosphorylierung der Proteine zu verhindern. Mittels Ultraschallsonde wurde eine Hälfte der Proben in detergentienfreiem Puffer, die andere in RIPA-Puffer homogenisiert. Die Proteinquantifizierung der Proben erfolgte mithilfe eines BCA-Assays und anschließender Verdünnung auf die jeweils gleiche Endkonzentration. Aβ-Peptide wurden aus RIPA-Hirnhomogenat durch Immunpräzipitation gewonnen. Tau und ERK-Proteine wurden aus den Proben bestimmt, die in detergentienfreiem Puffer gelöst waren. Die Analyse der Proben erfolgte im Western-Blot-Verfahren mit anschließender statistischer Auswertung. Ergebnisse und Beobachtungen Es konnte gezeigt werden, dass im temporalen Cortex der Alzheimer-Patienten eindeutig der größte Anteil carboxy-terminal verlängerter Aβ-Peptide und pathologisch hyperphosphoryliertes Tau-Protein nachweisbar war. In diesem Gehirnareal stellte sich außerdem in der Korrelationsanalyse der einzelnen Alzheimer-Proben ein signifikantes Ergebnis im Verhältnis zwischen phosphorylierter, also aktivierter, und absoluter Menge extra-zellulär-regulierter Kinase ERK 1/2 dar. Dies spricht für eine sehr starke Aktivität dieser Proteinkinase bei Alzheimer-Patienten im temporalen Cortex - jenem Gehirnareal, in dem die Erkrankung entsteht. Somit scheint ERK 1/2 eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der Alzheimer-Demenz zu spielen. Auch im frontalen Cortex und im Cerebellum konnte bei den Alzheimer-Proben mehr phosphoryliertes ERK 1/2 als bei den gesunden Kontrollproben nachgewiesen werden, allerdings zeigte sich hier in der Einzelanalyse eine hohe Variabilität zwischen dem phosphorylierten und unphosphorylierten Anteil der Kinase. In den Kontrollproben fand sich erwartungsgemäß in allen Gehirnregionen sehr wenig phosphoryliertes ERK. Ebenso ließ sich in den Kontrollproben kein pathologisch phosphoryliertes Tau-Protein sowie zwar C-terminal, aber keine N-terminal veränderten Aβ-Peptide nachweisen. Praktische Schlussfolgerungen Da der Anteil von phosphoryliertem zu nativem ERK bei den Alzheimer-Proben im temporalen Cortex signifikant erhöht war, könnte sich hiermit die Möglichkeit eines neuen, zusätzlichen diagnostischen Biomarkers ergeben. Bisher wird in der klinischen Diagnostik Liquor auf Tau-Protein, phosphoryliertes Tau und Aβ-Peptide hin untersucht. Dabei erhöht die kombinierte Evaluation mehrerer Biomarker die diagnostische Spezifität. Somit könnte die ergänzende Messung von phosphoryliertem ERK und ERK im Liquor zur Früherkennung der Erkrankung und zur Entwicklung neuer diagnostischer Konzepte beitragen.Background and Intention Alzheimer’s disease is the most common form of dementia in the elderly population. Symptomatic are progressive disturbances in cognitive functions. The characteristic neuropathological hallmarks are extracellular neuritic plaques containing the β-amyloid peptide and neurofibrillary tangles composed of hyperphosphorylated forms of tau protein. This pathological change of tau conformation leads to its detachment from microtubules, breakdown of intracellular transport and finally neurodegeneration. Responsible for this aberrant hyperphosphorylation of tau seemed to be an imbalance of kinase and phosphatase activity. In this study post mortem brain samples of Alzheimer’s patients and age-matched controls were analyzed. The samples originated from three different brain areas, i.e. from the temporal and frontal cortex as well as from the cerebellum. The examination encompassed the distribution of Aβ-peptides, the phosphorylation-level of tau protein as well as the phosphorylation and therefore rate of activity of the extracellular regulated kinase ERK 1/2, a kind of Tau-Kinase, in the different brain regions. Consequently, the possible influence of this proteinkinase in the development of Alzheimer´s dementia should be demonstrated. Methods The preparation of the brain tissue was done under cooling to avoid early desphosphorylation of the protein. By means of an ultrasound probe, half of the samples were homogenized in a detergent free buffer, the other half in a RIPA- buffer. The quantifying of the protein contained in the samples was facilitated by application of a BCA-Assay and subsequent dilution to equal concentration. Aß-peptides were extracted out of the RIPA-brain homogenate by immune prepicitation. Tau- and ERK-proteins were only obtained from samples which had been dissolved in detergent-free buffer. The final analysis of the samples was conducted using the Western-Blot-Method and subsequent statistical validation. Results It was found that the main part of carboxy-terminal elongated Aß-peptides, as well as pathologically hyperphosphorylated Tau-protein ocurred in the temporal cortex of Alzheimer’s patients. For those samples the correlation analysis showed a significant result for the ratio of phosphorylated and the absolute amount of extra-cellular-regulated Kinase ERK 1/2. This implies an intense activity of this proteinkinase in Alzheimer´s patients’ temporal cortex - the very same brain area where the disease originates. Therefore, ERK 1/2 appears to play a decisive role in the pathogenesis of Alzheimer’s dementia. More phospho-ERK was also found in the frontal cortex and in the cerebellum of the Alzheimer samples than in those of the control group, but the detailed analysis showed a high variability between phosphorylated and unphosphorylated proportion of the kinase. In the control samples, as expected, very little phophorylated ERK was found. Nor was any pathologically phosphorylated Tau-protein encountered, and though C-terminal was detected, no N-terminal variated Aß-peptides were found. Conclusions The significantly increased fraction of phosphorylated ERK in the temporal cortex of the Alzheimer samples renders the possibility of a new and additional diagnostic biomarker. So far, in clinical diagnosis the cerebrospinal fluid is primarily examined for Tau-protein, phosphorylated Tau and Aß- peptides. Hence, the combined evaluation of several biomarkers augments the diagnostic precision and therefore an additional measuring of phosphorylated ERK and ERK in the cerebrospinal fluid could contribute to an early diagnosis of Alzheimer’s disease and the development of further complementary diagnostic methods