Charakterisierung eines multimeren Proteinkomplexes, der den nukleären Kapsidexport des humanen Cytomegalovirus steuert

Human cytomegalovirus (HCMV) has developed a replication strategy that is well adapted to conditions of the host cell. Notably, after nuclear capsid assembly, HCMV capsids traverse the nuclear envelope for nuclear egress. In this regard, the phosphorylation-mediated disassembly of the nuclear lamina is believed to be a prerequisite for the budding of viral capsids through the nuclear membrane. Although the interplay between the nuclear lamina-associated viral proteins pUL50 and pUL53 with viral and cellular protein kinases has been considered for several years, the exact molecular events for HCMV nuclear egress were still unclear. In this thesis, yeast two-hybrid and coimmunoprecipitation analyses were applied to detect the interaction of pUL50 with three proteins. Hereby, partly overlapping interaction domains could be identified and pUL50-associated protein complexes could be isolated using lysates of transiently transfected and HCMV-infected cells. As illustrated by immunofluorescence costaining analyses, the direct interaction of pUL50 with protein kinase C (PKC) could be confirmed and recruitment of PKC to the nuclear rim of transiently transfected cells was demonstrated. Interestingly, viral protein kinase pUL97 was also recruited by pUL50, although through a different mechanism lacking direct interaction. Experimental evidence pointed to an indirect bridging of pUL50-associated proteins mediated by the cellular adaptor p32. Combined, these data suggested the formation of a nuclear egress complex (NEC) which includes at least pUL50, pUL53, p32, the lamin B receptor and the two protein kinases pUL97 and PKC. Reports describing the ability of pUL97 and PKC to phosphorylate several types of lamins, coincided with the finding in this study that pUL97 and PKC had the potential to induce distinct, punctate lamina-depleted areas at the nuclear periphery in transiently transfected as well as HCMV-infected cells. Using a recombinant HCMV, the direct transition of GFP-labeled viral capsids through these areas could be visualized. To discover the molecular mechanism driving the NEC-mediated nuclear lamina destabilization, bioinformatical analyses were performed concerning the pUL97-dependent phosphorylation of lamin A/C at serine 22. As an important finding, phosphorylation at this specific serine generated a putative binding motif for the peptidyl-prolyl cis/trans isomerase Pin1. Interaction between Pin1 and lamin A was confirmed in HMCV-infected fibroblasts. Furthermore, the physiological localization of Pin1 was altered, leading to recruitment of Pin1 to the nuclear lamina late during infection. The local increase of Pin1 isomerase activity was suggested to promote conformational modulation of nuclear lamins. Taken together, this study strongly suggests the formation of a viral-cellular NEC which is required for the phosphorylation-triggered destabilization of the nuclear lamina during HCMV nuclear egress.Das humane Cytomegalovirus (HCMV) hat eine Replikationsstrategie entwickelt, die sehr gut an die regulatorischen Prozesse der Wirtszelle angepasst ist. Insbesondere ist es für den viralen Kernexport notwendig, dass die neuformierten Kapside die Kernmembran überwinden. Diesbezüglich wird die phosphorylierungsabhängige Destabilisierung der nukleären Lamina als Vorraussetzung für das Ausschleusen der viralen Kapside durch die Kernmembran betrachtet. Obwohl die Lamina-assoziierten viralen Proteine pUL50 und pUL53 über Jahre hinweg analysiert sowie deren Wechselwirkung mit viralen als auch zellulären Faktoren diskutiert worden waren, blieben Details der molekularen Vorgänge des HCMV-Kernexports im Unklaren. In der vorliegenden Arbeit, wurde die Interaktion von pUL50 mit drei Proteinen durch das Hefe-Zwei-Hybrid-System und Koimmunpräzipitationsanalysen nachgewiesen. Hierbei wurden überlappende Interaktionsbereiche für diese Bindungspartner identifiziert und pUL50-assoziierte Proteinkomplexe konnten sowohl in transfizierten als auch in HCMV-infizierten Zellen isoliert werden. Mit Hilfe von Immunfluoreszenz-Mehrfachfärbungen konnte die Interaktion zwischen pUL50 und der Proteinkinase C (PKC) bestätigt sowie eine Rekrutierung von PKC an die Zellkernperipherie demonstriert werden. Interessanterweise wurde die virale Proteinkinase pUL97 ebenfalls von pUL50 rekrutiert, wobei dies nicht durch eine direkte Interaktion vermittelt wurde. Experimentelle Hinweise deuteten auf eine indirekte Adaptorwirkung durch den zellulären Faktor p32 hin. Diese Daten legen die Bildung eines nukleären Egress-Komplexes (NEC) nahe, der pUL50, pUL53, p32, den Lamin B-Rezeptor und die Proteinkinasen pUL97 und PKC beinhaltet. Berichte über die Phosphorylierung verschiedener Lamintypen durch pUL97 und PKC, deckten sich mit der Beobachtung dieser Arbeit, dass beide Proteinkinasen in transfizierten als auch in HCMV-infizierten Zellen ausgeprägte, Lamin-freie Bereiche am Rande der Kernhülle induzieren können. Mit Hilfe eines rekombinanten Virus konnten GFP-markierte HCMV Kapside beim Durchqueren dieser Bereiche beobachtet werden. Um den molekularen Mechanismus der NEC-vermittelten Destabilisierung der nukleären Lamina aufzuklären, wurde die pUL97-abhängige Phosphorylierung von Serin 22 des Lamin A/C mittels Bioinformatik-Methoden untersucht. Ein wichtiger Befund bestand in der Entdeckung eines mutmaßlichen Bindemotivs für die Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerase Pin1 an diesem phosphorylierten Serin. Die Interaktion zwischen Pin1 und Lamin A konnte in HCMV-infizierten Fibroblasten erstmals demonstriert werden. Im Weiteren wurde die intrazelluläre Lokalisation von Pin1 so verändert, dass in der späten Phase der Infektion eine Rekrutierung von Pin1 an die nukleäre Lamina nachweisbar war. Die Pin1-Isomerase-Aktivität könnte somit für eine Restrukturierung der nukleären Lamine maßgeblich sein. Zusammenfassend liefert diese Studie einen deutlichen Hinweis für die Bildung eines viral-zellulären NEC, welcher für die phosphorylierungsabhängige Auflösung der nukleären Lamina während des HCMV-Kernexports notwendig ist