Novel antibody-derivatives for the immunotherapy of acute myeloid leukemia

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine heterogene Erkrankung des hämatopoietischen Systems mit einer charakteristischen unkontrollierten Proliferation von undifferenzierten myeloischen Blasten. Die Entdeckung von leukämischen Stammzellen (LSZ) der AML erlaubt wichtige klinisch relevante Schlussfolgerungen, da deren spezifische Eliminierung die effektivste Möglichkeit für eine verbesserte AML-Therapie darstellt. Zu diesem Zweck wurden vier single-chain Fv (scFv) Antikörper-Fragmente, spezifisch für das leukozytäre Oberflächenantigen CD123 (IL-3Rα) hergestellt. Diese wurden für die Konstruktion rekombinanter Antikörper-Derivate verwendet, um ein präferentielles Anvisieren von AML-LSZ zu ermöglichen. Der scFv mit der höchsten Affinität wurde für die Konstruktion zweier unterschiedlicher, den Zelltod-induzierender Moleküle verwendet. Erstens wurde ein Fusionsprotein mit einer verkürzten Variante des Pseudomonas Exotoxin A (CD123-ETA‘) und zweitens ein bispezifischer scFv (bsscFv [123 x ds16]) durch Fusion an einen zweiten scFv mit Spezifität für CD16 (FcγRIII) hergestellt. CD123-ETA‘ induzierte Antigen-spezifisch die Apoptose von zwei AML-abgeleiteten Zelllinien, MOLM-13 und SKNO-1, mit EC50-Werten von 6 und 4 nM. In Zytotoxizitäts-Experimenten mit CD123-ETA‘ und CD33-ETA‘, einem weiteren AML-spezifischen Immuntoxin, wurde eine kom¬binatorische Wirkung gegen CD123 und CD33 doppelt positive MOLM-13 Zellen beobachtet. In Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizitäts-Experimenten (ADCC) vermittelte der bsscFv [123 x ds16] effektive Lyse von Tumorzellen mit niedrig picomolaren Konzentrationen. Die beobachteten EC50-Werte waren 211 pM für MOLM-13, 364 pM für THP-1 und 297 pM für SKNO-1. Für eine weitere Verbesserung des bsscFv-Formats wurden zwei scFv triplebodies (sctb), bestehend aus einer Polypeptidkette mit drei hintereinander folgenden scFvs, entworfen. Erstens wurde der dual-targeting sctb [123 x ds16 x 33], spezifisch für CD123 und CD33 für eine höhere Selektivität für die LSZ und CD16 auf der Effektorzelle und zweitens der mono-targeting sctb [123 x ds16 x 123] spezifisch für CD123 und CD16 hergestellt. In ADCC-Experimenten zeigten beide Konstrukte eine effektive Lyse von AML-abgeleiteten Zelllinien. Für den sctb [123 x ds16 x 33] wurden EC50-Werte von 21 pM (MOLM-13) und 118 pM (THP-1) bestimmt. Der sctb [123 x ds16 x 123] induzierte ADCC mit EC50-Werten von 50 pM (MOLM-13) und 212 pM (THP-1). Die sctbs induzierten ebenfalls potente ADCC primärer Zellen aus peripherem Blut oder Knochenmark von AML Patienten. Für einen direkten Vergleich wurde der bereits existierende sctb [33 x ds16 x 33] in diese Experimente mit einge¬schlossen. Obwohl nicht statistisch signifikant, induzierte der dual-targeting sctb [123 x ds16 x 33] durchschnittlich die höchste Maximallyse des Patientenmaterials. Diese Daten deuten darauf hin, dass alle vier Moleküle, CD123-ETA‘, bsscFv [123 x ds16] und die beiden sctbs, vielversprechende Kandidaten für weitere präklinische Untersuchungen sind. Besonders der dual-targeting sctb [123 x ds16 x 33] bietet Potential für ein präferentielles Anvisieren der AML-LSZ.Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous hematopoietic malignancy characterized by un¬controlled proliferation of undifferentiated myeloid blasts. The recent discovery of leukemic stem cells (LSCs) in AML has important clinical implications, because their specific elimination offers a most favorable opportunity to improve AML treatment. For this purpose four single-chain Fv antibody fragments (scFv) specific for the human leukocyte surface antigen CD123 (IL-3Rα) were generated for the construction of recombinant antibody-derivatives to achieve preferential targeting of AML-LSCs. The scFv with the highest affinity was used to design two different cell-death inducing molecules. First, an immunotoxin (CD123-ETA’), a fusion protein with a truncated variant of Pseudomonas Exotoxin A and second, a fusion to a second scFv specific for CD16 (FcγRIII), creating a bispecific scFv (bsscFv [123 x ds16]). CD123-ETA’ was able to induce antigen specific apoptosis of the two different AML-derived cell lines MOLM-13 and SKNO-1 with EC50-values of 6 and 4 nM, respectively. In cytotoxicity experiments a combined effect of CD123-ETA’ and CD33-ETA’, another AML-specific immunotoxin, on CD123 and CD33 double positive MOLM-13 cells was observed. In antibody-dependant cellular cytotoxicity (ADCC) expe¬ri¬ments bsscFv [123 x ds16] mediated effective tumor cell lysis at low picomolar concentrations. The observed EC50-values were 211 pM for MOLM-13, 364 pM for THP-1 and 297 pM for SKNO-1. For further improvement of the bsscFv-format two novel scFv triplebodies (sctbs), consisting of one polypeptide chain with three scFvs in tandem were designed. A dual-targeting sctb [123 x ds16 x 33] specific for CD123 and CD33 for an improved LSC-selectivity and CD16 on the effector cell and a mono-targeting sctb [123 x ds16 x 123] specific for CD123 and CD16 were produced. In ADCC ex¬per¬iments both constructs displayed effective lysis of AML-derived cell lines. The determined EC50-values for sctb [123 x ds16 x 33] were 21 pM (MOLM-13) and 118 pM (THP-1). Sctb [123 x ds16 x 123] induced ADCC with EC50-values of 50 pM (MOLM-13) and 212 pM (THP-1). The sctbs also induced potent ADCC of primary cells from peripheral blood or bone marrow of AML patients. For a direct comparison the existing mono targeting sctb [33 x ds16 x 33] was included in these exper¬iments. Although not statistically significant, the dual-targeting sctb [123 x ds16 x 33] induced the highest maximum lysis averaged over all patients. These data indicate that all four molecules, CD123-ETA’, bsscFv [123 x ds16] and the two sctbs, are valuable candidates for further pre-clinical investigations. Especially the dual-targeting sctb [123 x ds16 x 33] offers the potential for a preferential targeting of AML-LSCs