Die Rolle von regulatorischen T Zellen im Knochenmetabolismus

The objective of this Ph.D. thesis was to investigate the role of regulatory T cells (Tregs) in physiological and pathological bone remodeling. We first in vitro characterized the suppressive effects of Tregs on the differentiation of the bone resorptive cells or osteoclasts. The effect was found to be directly mediated and to require cell to cell contact between the monocytic precursors of osteoclasts and Tregs. In addition, Tregs mediated expression of TGFβ, IL-4 and IL-10 contributed, but was not essential, to the inhibitory effect on osteoclastogenesis. The co-stimulatory receptor CTLA-4 expressed on the surface of Tregs was the main mediator of their suppressive effect that was abolished in monocytes lacking both the CTLA-4 ligands CD80 and CD86. These in vitro data showing that CD4+CD25+Foxp3+ Tregs suppress osteoclast formation, prompted us to in vivo investigate the role of Tregs in bone homeostasis. We therefore analyzed bone parameters of mice with increased Treg numbers (foxp3-transgenic mice). Indeed foxp3tg mice developed high bone mass and were protected from ovariectomy-induced osteoporosis; inflammatory osteopenia and arthritic bone destruction, whereas foxp3-deficiency enhanced bone loss. Tregs directly protect against bone loss since a significant increased bone mass was observed following adoptive Tregs transfer in RAG1 deficient mice (RAG1-/-). The positive skeletal effects of Tregs were entirely mediated through inhibition of bone resorption by osteoclasts. Binding of Tregs to CD80/CD86 on osteoclast precursors was essential for inhibiting osteoclast differentiation in vivo as shown by the osteopenic phenotype that developed in CD80/86 deficient mice (CD80/86-/-) due to increased osteoclast differentiation. Mechanistically, engagement of CD80/86 by Tregs through CTLA-4 induced IDO expression in osteoclast precursors and thereby increased tryptophan catabolism and apoptosis. These effects were not found in CD80/86 deficient osteoclast precursors. In summary, the presented in vitro and in vivo results demonstrate that Foxp3+ Tregs can actively and directly control bone resorption during physiological and pathological bone remodeling and thus preserve bone mass. Consequently, immune regulation is actively protecting bone mass.Ziel dieser Doktorarbeit war es, zu klären ob und wie regulatorische T Zellen (Tregs) die Osteoklasten Differenzierung in vitro sowie den Knochenstoffwechsel in vivo beeinflussen können. Diese Fragestellungen sollten nicht nur einen tieferen Einblick in die Interaktion von Immunsystem und Knochen erzielen, sondern auch dazu dienen, Strategien zu entdecken, wie das Immunsystem den Knochenabbau verhindert. Dazu wurden CD4+CD25+Foxp3+ T Zellen (Tregs) isoliert und mit CD11b+ Osteoklastenvorläuferzellen kultiviert. Die Osteoklasten Differenzierung wurde mittels einer Tartrat-resistenten sauren Phosphatase (TRAP) Färbung nach 4-6 Tagen in Kultur untersucht. Zudem wurde die Fähigkeit der Osteoklasten zur Knochenresoprtion mittels Resorptionassay auf Osteologic TM Platten analysiert, Transwell-Kulturexperimente durchgeführt und Zytokine blockiert, um die Mechanismen der Interaktion zwischen Tregs und Osteoklasten aufzuklären. Wir konnten zeigen, dass regulatorische CD4+CD25+Foxp3+ T Zellen im Gegensatz zu CD4+CD25-, Foxp3- T Zellen die Osteoklastendifferenzierung durch M-CSF und RANKL dosisabhängig blockieren. Deren resorptive Aktivität war bis zu 80% reduziert sobald Tregs zu Osteoklasten Vorläuferzellen gegeben wurden. Die Blockade der Osteoklastendifferenzierung basierte nicht auf einem Ungleichgewicht zwischen RANKL und OPG Verhältnis, sondern war wesentlich von einem direkten Zell-Zell Kontakt zwischen CTLA-4 auf Tregs und CD80/86 auf Osteoklastenvorläuferzellen abhängig. Die Expression von TGFβ, IL-4 und IL-10 durch Tregs, hatte einen zusätzlichen blockierenden Effekt auf die Osteoklastendiffernzierung, war aber nicht essentiell für die inhibitorische Wirkung von Tregs auf die Osteoklastogenese verantwortlich. Diese ersten in vitro Daten zeigen, dass CD4+CD25+Foxp3+ Tregs die Differenzierung von Osteoklasten aus Osteoklastenvorläuferzellen hemmen können und zeigen eine neue regulierende Beziehung zwischen dem Immunsystem und dem Knochenstoffwechsel. In den folgenden in vivo Versuchen stellten wir uns die Frage ob diese regulierende Beziehung zwischen dem Immunsystem und dem Knochenstoffwechsel auch in vivo nachweisbar ist. Dazu konnten wir zeigen, dass Mäuse mit einem erhöhten Anteil an Tregs (foxp3-transgene Mäuse) eine signifikant erhöhte Knochendichte aufweisen. Zudem waren foxp3-transgene Mäuse sowohl von der postmenopausalen Osteoporose als auch von inflammatorischer Osteopenie und arthritischer Knochendestruktion geschützt. Tregs erhöhten zudem die Knochenmasse in Lymphozyten-defiziente RAG1-/- Mäuse (RAG1-/-), wobei nach adoptiven Transfer von Treg eine signifikant höhere Knochendichte zu beobachten war. Die beschriebenen positiven Effekte der Tregs auf die systemische Knochendichte wurden durch die Hemmung der Knochenresoption durch Osteoklasten verursacht. Der direkte Kontakt von Tregs mit CD80/86 auf Osteoklastenverläuferzellen war essentiell für die Hemmung der Knochenresoption durch Osteoklasten. In Übereinstimmung damit zeigen CD80/86 knock-out Mäuse (CD80/86-/-) einen osteoporotischen Phänotyp basierend auf einer erhöhten Anzahl an Osteoklasten. Die Binding von CD80/86 durch CTLA-4 auf Tregs induziert in Osteoklastenvorläuferzellen die Expression von IDO und somit einen verstärkten Tryptophan Stoffwechsel was dazu führt das Osteoklastenvorläuferzellen vermehrt apoptotisch werden und sich somit nicht in reife knochenresorbierende Osteoklasten differenzieren können. Osteoklastenvorläuferzellen aus CD80/86-/- Mäusen zeigen keine Hochregulierung der IDO mRNA Expression und werden nach Kontakt mit CTLA-4 Ig oder Tregs auch nicht apoptotisch. Zusammenfassend kann man sagen dass die hier präsentierten in vitro sowie in vivo Daten zeigen, dass Tregs direkt die Knochenresorption sowohl im physiologischen als auch im pathologischen Knochenstoffwechsel kontrollieren und somit eine neue wichtige Verbindung zwischen dem Immunsystem und dem Knochenstoffwechsel darstellen