Charakterisierung der Interregulation zwischen Zyklin-abhängigen Proteinkinasen und regulatorischen Proteinen des Humanen Cytomegalovirus

Replication of human cytomegalovirus (HCMV) includes various key issues of virus-host cell interaction. Notably, cyclin-dependent protein kinases (CDKs) are functionally integrated into efficient viral gene expression and protein modification. Although CDK1, -2, -7, and -9 have been considered as potential HCMV-regulating kinases, the underlying regulatory mechanisms are still unclear. In this thesis, primary human fibroblasts with siRNA-mediated knockdown of individual CDKs were generated. Subsequent infection experiments demonstrated a substantial reduction of HCMV replication efficiency in CDK knockdown cell populations. In order to gain a deeper insight into the HCMV-CDK interregulation, yeast two-hybrid experiments were performed which defined viral proteins as direct interactors of CDK9/cyclin T1. Moreover, for one of the identified proteins, the mRNA export factor pUL69, coimmunoprecipitation analyses determined the cyclin subunit as the direct binding partner. Interestingly, it was reported that pharmacological inhibition of CDKs induces intranuclear aggregation of pUL69. This phenomenon of subnuclear pUL69 aggregates was thereafter characterized in detail. Infection experiments with therapy-resistant cytomegalovirus variants revealed strain-specific quantitative differences in CDK inhibitor-induced pUL69 aggregates. Further immunofluorescence analyses identified pUL69 aggregates as a constituent of viral replication centers, but not spliceosomes, nuclear pore complexes or aggresome structures. A report describing viral protein kinase pUL97 as a viral CDK ortholog was coincide with the finding that inhibition of pUL97 activity produced similar pUL69 aggregates, indicating a combined fine-regulation of the intranuclear pUL69 localization by the viral CDK ortholog pUL97 along with CDKs. Remarkably, pUL69 entirely colocalized with CDK9 and cyclin T1 in aggregates induced by CDK inhibitors. Subsequent in vitro phosphorylation analyses identified cytomegaloviral proteins, in particular pUL69, as specific substrates of CDK/cyclin complexes. This CDK-mediated phosphorylation of pUL69 appeared to contribute to its mRNA export activity since CDK inhibitors effected a significant decline in pUL69-dependent mRNA export when using a reporter assay. Taken together, this study provides evidence for a distinct regulatory role of CDKs on cytomegaloviral proteins and particulary implies for CDK9/cyclin T1 to have a direct impact on the functionality of pUL69.Die Replikation des humanen Cytomegalovirus (HCMV) weist zahlreiche Schlüsselmerkmale einer sehr engen Virus-Wirtszellinteraktion auf. Insbesondere sind Zyklin-abhängige Proteinkinasen (CDKs) funktionell mit einer effizienten viralen Genexpression und Proteinmodifikation verknüpft. Obwohl CDK1, -2, -7 und -9 als potenzielle HCMV-regulierende Proteinkinasen diskutiert wurden, waren die zugrunde liegenden regulatorische Mechanismen weitgehend ungeklärt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden primäre humane Fibroblasten mit einer siRNA-vermittelten Suppression (knockdown) für einzelne CDKs generiert. Infektionsexperimente zeigten in CDK-knockdown-Zellpopulationen eine deutliche Reduktion der HCMV-Replikation. Um die HCMV-CDK-Wechselwirkung genauer zu definieren, wurden zunächst Hefe-Interaktionsexperimente durchgeführt, welche virale Proteine identifizierten, die direkt mit CDK9/Zyklin T1 interagierten. Für eines der identifizierten Virusproteine, den mRNA-Exportfaktor pUL69, konnte in weiterführenden Koimmunpräzipitationsanalysen gezeigt werden, dass die Zyklin-Unterheit als direkter Interaktionspartner fungiert. Der Bericht einer nukleären Aggregation von pUL69 durch pharmakologische Inhibition von CDK-Aktivität war der Ausgangspunkt für eine detaillierte Charakterisierung dieses Phänomens. Infektionsexperimente mit verschiedenen HCMV-Stämmen und -Mutanten belegten den Befund der CDK-Inhibitor-induzierten pUL69-Aggregate und zeigten darüberhinaus Virus-spezifische Unterschiede. Ferner konnte nachgewiesen werden, dass diese nukleären Feinstrukturen ein Bestandteil der viralen Replikationzentren, jedoch nicht der Spliceosomen, Kernporen oder Aggresomen, sind. Weitere Ergebnisse, die zeigten, dass Inhibition der viralen Proteinkinase pUL97 ähnliche pUL69-Aggregate hervorriefen, standen im Einklang mit Berichten, die pUL97 als virales CDK-Ortholog beschrieben. Interessanterweise konnte nur mit CDK-Inhibitoren, jedoch nicht mit Inhibitoren von pUL97, eine vollständige Kolokalisation zwischen pUL69 und CDK9 sowie Zyklin T1 in pUL69-Aggregaten nachgewiesen werden. Anschließende In vitro-Phosphorylierungsanalysen identifizierten cytomegalovirale Proteine, insbesondere pUL69, als spezifische Substrate von CDK/Zyklin-Komplexen. Die CDK-abhängige Phosphorylierung von pUL69 erwies sich als wichtiger Regulierungsmechanismus der mRNA-Exportaktivität: Unter der Wirkung von CDK-Inhibitioren wurde eine signifikante Abnahme des pUL69-abhängigen mRNA-Exports in einem Reporterassay nachgewiesen. Zusammenfassend konkretisiert diese Studie eine funktionelle Relevanz von CDKs für die Feinregulierung sowie Aktivität von cytomegaloviralen Proteinen und zeigt vor allem für CDK9/Zyklin T1 einen direkten Einfluss auf die Funktionalität von pUL69