Characterization of components of the ABA- and stress responsive regulatory network in Arabidopsis thaliana

Das Phytohormon Abszisinsäure (ABA) reguliert zahlreiche Prozesse der Pflanzenentwicklung und Adaptation an Wasser-, Salz- und Kältestress. Mit der Charakterisierung von vier Komponenten wurden neue Erkenntnisse zum Proteinabbau und RNA-Metabolismus im ABA-Signaltransduktionsnetzwerk gewonnen. 1. Charakterisierung von SAUL1 (Seneszenz-assoziierte E3-Ubiquitinligase 1): Mit einem in vitro Ubiquitinierungsassay konnte die Funktion von SAUL1 als E3 Ligase gezeigt werden. Damit ist SAUL1 über den Ubiquitin-26S-Proteasomweg am Proteinabbau beteiligt. Homozygote saul1 Mutanten entwickelten bei niedrigen Photonenflussdichten gelbe Blätter, ein charakteristisches Anzeichen für Seneszenz. Der Phänotyp der saul1 Mutanten wurde von einem reduzierten Chlorophyllgehalt, einer verminderten photochemischen Effizienz des Fotosystems II und einer veränderten Genexpression begleitet: Chlorophyll-aufbauende Gene wurden reprimiert, Chlorophyll-abbauende Gene, an Autophagozytose beteiligte Gene und Seneszenzmarkergene wurden induziert. Interessanterweise waren die saul1 Mutanten durch eine veränderte ABA-Biosynthese, nicht aber durch eine veränderte ABA-Signaltransduktion gekennzeichnet. In seneszenten saul1 Mutanten waren die Aktivität und die Menge des ABA-Biosyntheseproteins AAO3 im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöht. SAUL1 wurde in Blättern verschiedener Entwicklungsstadien und in Wurzeln, verstärkt v.a. in der Wurzelspitze und im Zentralzylinder, exprimiert. Analog dem Auftreten von Proteasomen in Kern und Zytoplasma zeigten YFP-SAUL1 Fusionsproteine eine vergleichbare Verteilung. Das aus den Ergebnissen aufgestellte Modell für saul1 Mutanten, die bei geringen Lichtintensitäten gewachsen waren, stimmt mit dem in seneszenten WT Pflanzen überein: Das Fehlen oder die Repression von SAUL1 macht eine Interaktion mit seinen Substraten (ev. AAO3) unmöglich. Entsprechende Substrate werden nicht ubiquitiniert und proteolysiert, sondern sind weiter aktiv. Mit AAO3 als Substrat hätte dies gesteigerte ABA-Gehalte zur Folge, die wiederum Seneszenz auslösen. SAUL1 ist ein wichtiger negativer Regulator der Blattseneszenz. 2. Untersuchung der beiden ABA-abhängigen putativ RNA-bindenden Proteine AtCSP41B (Arabidopsis thaliana Chloroplast-Stammschleife-bindendes Protein von 41kDa B) und cpRNP29 (Chloroplast-Ribonukleoprotein von 29 kDa): Durch Promotor-vermittelte Expression von GFP und GUS konnten für beide Gene fotosynthetisch aktive Gewebe (grüne Kotyledonen, Blätter, Blattstiele und Sepalen) als Expressionsorte in planta bestimmt werden. Die entsprechenden Proteine wurden in Chloroplasten lokalisiert. AtCSP41B wurde zusätzlich in Stromules detektiert. Für AtCSP41B wurde die Fähigkeit zur RNA-Bindung mittels Northwestern Blot und RNA-Gelshift-Assay nachgewiesen. Zur weiteren Aufklärung der physiologischen Funktion wurde die Genregulation von AtCSP41B und cpRNP29 studiert. Die starke Repression von AtCSP41B durch ABA, Wasserstress, Dunkelheit und Blattseneszenz, die Fähigkeit zur RNA-Bindung und die Lokalisierung in Chloroplasten lies eine Funktion von AtCSP41B bei der Regulation der Chloroplastenbiogenese vermuten. Das auffälligste Expressionsmuster für cpRNP29 war eine fotoperiodische Oszillation mit Peaks zum Ende der Lichtphase. Interpretiert man dies gemäß neuesten Erkenntnissen, könnte cpRNP29 an der Zellelongation mitwirken, die Vorgänge wie Kotyledonenbewegung und Hypokotylelongation umfasst. Allerdings waren Verlustmutanten von cpRNP29 und Pflanzen mit einer verringerten Expression von AtCSP41B unter normalen Wachstumsbedingungen phänotypisch unauffällig. 3. Analyse von AtPRP4 (Arabidopsis thaliana-Prekursor-RNA-prozessierendes Protein 4): Bei dem homologen Hefeprotein yPRP4 handelt es sich um einen essentiellen Spleißfaktor, der mit dem U4/U6 Komplex des Spleißosoms assoziiert ist. Ein Hinweis auf eine hohe Relevanz dieses Faktors in planta wurde durch das Fehlen homozygoter Arabidopsis prp4 Mutanten zweier verschiedener Allele gegeben. In heterozygoten prp4 Pflanzen war die Hälfte der Samen abortiv und unbefruchtet. Das Segregationsverhältnis von Nachkommen heterozygoter Pflanzen betrug 1:1 (Wildtyp:heterozygot). Diese Beobachtungen sprachen für einen Defekt des weiblichen Gametophyten. Ein weiteres bekanntes Allel der prp4 Mutante ist die lachesis Mutante, bei der im weiblichen Gametophyt die Ausbildung von akzessorischen und gametischen Zellen gestört ist und alle sieben Zellen über einen gametischen Charakter verfügen. Das AtPRP4 Gen zeigte eine Expression in allen Samenentwicklungsstadien als auch in adulten Geweben (Wurzel, Blatt, Kelchblatt, Staubblatt, Pistill). Ein Indiz für die postulierte Rolle als Spleißfaktor war die gezeigte Lokalisation im Kern und im Zytoplasma. Da es sich bei AtPRP4 um ein ABA-reprimiertes Gen handelt, wurde die Verknüpfung von ABA mit dem Spleißosom betrachtet. ¼ aller am Spleißprozess beteiligten snRNPs (kleine nukleäre Ribonukleoproteine) waren durch ABA reguliert.The plant hormone abscisic acid is involved in plant development as well as in the adaptation to environmental stresses such as drought, salinity or cold. The characterization of these four components led to new findings concerning protein degradation and RNA metabolism in the ABA signal transduction network. 1. Characterization of SAUL1 (senescence-associated E3-ubiquitin-ligase 1): With an in vitro ubiquitination assay, the E3 ubiquitin-ligase activity of SAUL1 was confirmed. Thus, SAUL1 is involved in protein degradation via the Ubiquitin-26S-proteasome pathway. Under low light conditions, homozygous saul1 mutant plants exhibited yellowing leaves, a matter of a typical symptom of senescence. The visible yellowing of leaves in saul1 mutants was accompanied by reduced chlorophyll contents, decreased photochemical efficiency of photosystem II and a corresponding modified gene expression: chlorophyll-synthesizing genes were reduced, chlorophyll-degrading genes, autophagy involved genes and senescence marker genes were induced. Interestingly, saul1 mutant plants exhibited a modified ABA biosynthesis, whereas the ABA signal transduction was not affected. In senescing saul1 mutants, the enzyme activity and protein level of the ABA biosynthesis protein AAO3 increased in comparison to control plants. SAUL1 was expressed especially in leaves of different developmental stages and in roots, where it is intensified most notably in the root tip and the central cylinder. The distribution of expressed YFP-SAUL1 fusion proteins corresponded to the existence of proteasomes in the nucleus and the cytoplasm. Our results supported a model for saul1 mutant plants, which were grown under low light, that is transferable to senescing wildtype plants: The absence or the repression of SAUL1 proteins disturbs the interaction with their substrates (maybe AAO3). Corresponding substrates will not be ubiquitinated and proteolysed but stay active. AAO3 as a substrate would result in increased ABA contents that in consequence lead to senescence. SAUL1 was established as a negative regulator of leaf senescence. 2.Investigation of the two ABA-dependent putative RNA-binding proteins AtCSP41B (chloroplast stem-loop binding protein of 41 kDa B) and cpRNP29 (chloroplast ribonucleoprotein of 29 kDa): Promotor-driven expression of GFP and GUS revealed photosynthetic active tissues (green cotyledons, leaves and petioles) as sites of expression for both genes in planta. The corresponding proteins were localized in chloroplasts. In addition, AtCSP41B was also detected in stromules. The RNA-binding capability for AtCSP41B was shown via northwestern blot and RNA-gelshift. A further step to reveal the physiological function was studying the regulation of the AtCSP41B and cpRNP29 gene. Strong repression of AtCSP41B upon ABA treatment, water stress, darkness and leaf senescence, the capability to bind RNA as well as the localization in chloroplasts suggested that AtCSP41B might have a function in the regulation of chloroplast biogenesis. The most noticeable expression pattern for cpRNP29 was a photoperiodical oscillation with peak levels towards the end of the light phase. According to latest findings, cpRNP29 may participate in cell elongation including processes like cotyledon movement and hypocotyl elongation. However, cpRNP29 mutants and plants with reduced AtCSP41B expression did not show any phenotypic alterations. 3. Analyses concerning AtPRP4 (Arabidopsis thaliana precursor-RNA-processing protein 4): The yeast homolog yPRP4 is an essential splicing factor which is associated to the U4/U6 complex of the spliceosome. The absence of homozygous prp4 mutant Arabidopsis plants from two independent T-DNA-insertion lines indicated the important role for this factor in planta. In heterozygous prp4 mutant plants half of the seeds were abortive and unfertilized. The ratio of segregating heterozygous plants was 1:1 (wildtype:heterozygous). These observations suggested a female gametophytic defect. A further known allele of prp4 is the lachesis mutant, which has a defective formation of accessory and gametic cells in the female gametophyte with all seven cells differentiating gametic cell fate. The AtPRP4 gene exhibited an expression in all seed stages as well as in adult tissues (root, leaf, sepal, pistil). One evidence for its postulated role as a splice factor was the demonstrated localization in the nucleus and the cytoplasm. Due to the fact that the AtPRP4 gene was repressed by ABA, the connection between ABA and the spliceosome was examined. Surprisingly, as many as 25% of the snRNPs (small nuclear ribonucleoproteins), that contribute to the splice process, were ABA-regulated