AAA+ Proteasen in Corynebacterium glutamicum und ihr Einfluss auf die Stickstoffregulation

Corynebacterium glutamicum is a Gram-positive soil bacterium belonging phylogenetically to the group of mycolic acid-containing actinomycetes. It has achieved outstanding biotechnological importance as an L-glutamate producing bacterium and is also used in various fermentation processes for the production of other amino acids like L-lysin, as well as nucleotides and vitamins. The cellular metabolism and especially the biosynthesis of amino acids strictly depend on the availability of nitrogen sources. To avoid a waste of energy and resources during the adaptation to varying nitrogen supply the organism features regulatory mechanisms that control nitrogen uptake and assimilation on the levels of gene expression, enzyme activity and proteolysis. This regulation is termed “nitrogen control”. The PII signal transduction protein GlnK plays a key role in the cell’s response to limiting nitrogen supply. GlnK is not present in cells that grow in ammonium-rich medium, but it is synthesised and adenylylated in response to ammonium limitation. By interacting with the repressor AmtR it causes a derepression of nitrogen regulated genes. An improvement of the nitrogen status leads to a deadenylylation of G lnK and its sequestration to the membrane. The localisation of GlnK at the membrane depends on the ammonium transporter AmtB and is the condition for the following GlnK degradation. The proteolysis of GlnK is influenced by the AAA+ proteases FtsH, ClpXP and ClpCP. In this study the global effects of the AAA+ proteases on proteome level and their influence on nitrogen metabolism were investigated. In contrast to other bacteria, the proteases in C. glutamicum were more involved in the regulation of energy and carbon metabolism, rather than in stress response. Another topic was the investigation of GlnK proteolysis on molecular level, whether all three proteases work together in GlnK degradation, or if only one protease is responsible and the impaired degradation in the other mutants is a jamming effect. Furthermore a probable degradation recognition signal of GlnK was analysed. Hints were obtained that the aminoterminal region of GlnK is involved into substrate recognition.Das Gram-positive Bodenbakterium Corynebacterium glutamicum gehört phylogenetisch zu den Mycolsäure-haltigen Actinomyceten und hat seit seiner Entdeckung in den 1950er Jahren eine herausragende biotechnologische Bedeutung erlangt. Neben seiner Fähigkeit zur Produktion großer Mengen an Aminosäuren wie L-Glutamat und L-Lysin wird C. glutamicum auch zunehmend für fermentative Produktionsprozesse anderer Aminosäuren sowie zur Herstellung von Nucleotiden und Vitaminen genutzt. Der zelluläre Stoffwechsel und insbesondere die Aminosäurebiosynthese sind dabei von einer ausreichenden Stickstoffverfügbarkeit abhängig. Um eine unnötige Verschwendung von Energie- und Nährstoffreserven zu vermeiden, besitzt der Organismus Regulationsmechanismen, die die Aufnahme und Assimilation von Stickstoffverbindungen steuern und die Anpassung der Zelle an variierende Stickstoffversorgung ermöglichen. Diese Kontrolle erfolgt auf den Ebenen der Genexpression, der Proteinaktivität und der Proteolyse und wird als „Stickstoffkontrolle“ bezeichnet. Das PII Signaltransduktionsprotein GlnK spielt in der Stickstoffkontrolle eine Schlüsselrolle. Es wird unter Stickstoffmangel synthetisiert und adenylyliert und ermöglicht durch Interaktion mit dem Repressor AmtR die Derepression stickstoffregulierter Gene. Verbessert sich die Stickstoffversorgung der Zelle, wird GlnK von GlnD demodifiziert und interagiert mit dem Ammoniumtransporter AmtB. Diese Verschiebung der Lokalisation von GlnK an die Membran ist außerdem die Vorraussetzung für den Abbau von GlnK, der von den AAA+ Proteasen FtsH, ClpXP und ClpCP beeinflusst wird. In dieser Arbeit wurden die globalen Auswirkungen der AAA+ Proteasen auf Proteomebene sowie deren Einflüsse auf den Stickstoffmetabolismus untersucht. Im Gegensatz zu den AAA+ Proteasen anderer Bakterien waren die Proteasen in C. glutamicum eher in den Energie- und Kohlenstoffmetabolismus und in die Aminosäurebiosynthese involviert, als in die Stressantwort. Des Weiteren wurde der GlnK-Abbau auf molekularer Ebene untersucht, im Hinblick darauf, ob alle drei Proteasen an dem GlnK-Abbau beteiligt sind oder ob nur eine Protease GlnK abbaut und man in den anderen Deletionsmutanten einen jamming effect beobachtete. Untersuchungen zu der möglichen Erkennungssequenz von GlnK als Signal für die Proteolyse ergaben verschiedene Hinweise auf einen Einfluss des aminoterminalen Bereiches von GlnK für die Substraterkennung