RNA-Bindung des Transaktivatorproteins UL69 des human Cytomegalovirus und seine Rolle für mRNA Export

The human cytomegalovirus protein UL69 is a member of a family of homologous regulatory proteins within the Herpesviridae which includes the proteins ICP27 of herpes simplex virus type 1 and EB2 of Epstein-Barr virus. Both ICP27 and EB2 have been shown to promote the nuclear export of a set of viral mRNAs via binding to the cellular mRNA export factor REF. Furthermore, a direct RNA-binding activity of ICP27 and EB2 was found to be essential for their stimulating effects on viral mRNA export. Recently, pUL69 has been demonstrated to share several properties with its herpesviral homologues suggesting that pUL69 might function as a viral mRNA export factor of human cytomegalovirus. It has been demonstrated that (i) pUL69 shuttles between the nucleus and the cytoplasm, (ii) the nucleocytoplasmic shuttling activity is essential for pUL69-mediated activation of gene expression and (iii) pUL69 interacts with cellular proteins involved in mRNA export. However, a direct role of pUL69 in mRNA export has not yet been shown. This study demonstrates that pUL69 can induce the cytoplasmic accumulation of an unspliced CAT reporter mRNA in transfected cells suggesting that pUL69 functions as an RNA export factor. One of the characteristic features of the viral mRNA export factors is the direct interaction with their RNA targets. Several experiments were performed to demonstrate that pUL69 can interact with RNA both in vivo and in vitro via a complex N-terminal RNA-binding domain consisting of three arginine-rich motifs. Interestingly, the RNA-binding domain of pUL69 overlaps with both the NLS and the binding site of the cellular mRNA export factors UAP56 and URH49. Whereas the deletion of the UAP56/URH49-binding site abolished pUL69-mediated mRNA export in transfected cells, an RNA-binding deficient pUL69 mutant which can still interact with UAP56/URH49 retained its RNA export activity. This suggests that, in contrast to its homologues, direct RNA interaction is not a prerequisite for the RNA export activity of pUL69, leastwise in a transient transfection system. To address the in vivo role of pUL69 for the HCMV replication cycle, a UL69 deficient HCMV (UL69) was generated. The analysis of expression of representative immediate early, early and late HCMV proteins in UL69-infected cells revealed that pUL69 appears to be required for the efficient expression of a subset of early and several late HCMV genes. The RNA transcripts of these genes could represent targets for pUL69-mediated mRNA export.Das Protein pUL69 des humanen Cytomegalovirus ist ein Mitglied einer Familie von homologen Regulatorproteinen innerhalb der Herpesviridae, die auch die Proteine ICP27 des Herpes simplex-Virus Typ I und EB2 des Epstein-Barr-Virus umfaßt. Für ICP27 und EB2 war gezeigt werden, daß sie den nukleären Export eines Subsets viraler RNAs durch Bindung an den zellulären mRNA Exportfaktor REF vermitteln. Weiterhin erwies sich eine direkte RNA-Bindungsaktivität von ICP27 und EB2 als essenziell ist für den RNA-Export. Aktuelle Studien ergaben, daß pUL69 mehrere Eigenschaften mit den homologen Proteinen anderer Herpesviren teilt: (i) es kann zwischen Zellkern und Zytoplasma wandern; (ii) die nukleäre Exportaktivität ist essenziell für die pUL69-vermittelte Aktivierung der Genexpression; (iii) pUL69 interagiert mit zellulären mRNA Exportfaktoren. Eine direkte Rolle von pUL69 für den nukleären mRNA Export war jedoch bisher noch nicht nachgewiesen worden. In dieser Arbeit wird gezeigt, daß pUL69 nach Transfektion die zytoplasmatische Akkumulation einer ungespleißten CAT-Reporter mRNA induzieren kann. Weiterhin konnte durch unterschiedliche experimentelle Ansätze nachgewiesen werden, daß pUL69 sowohl in vitro als auch in vivo unter Vermittlung einer komplexen, N-terminalen Domäne, die aus drei Arginin-reichen Motiven besteht, RNA binden kann. Interessanterweise überlappt die RNA-Bindungsdomäne des pUL69 sowohl mit dem nukleären Lokalisationssignal (NLS) als auch mit der Bindungsstelle der zellulären mRNA Exportfaktoren UAP56 und URH49. Während die Deletion der UAP56/URH49-Bindungsstelle zu einem Verlust der pUL69-vermittelten RNA-Exportaktivität führte, blieb bei einer RNA-bindungsdefizienten Mutante, die noch mit UAP56/URH49 interagierte, der RNA-Export erhalten. Dieser Befund weist darauf hin, daß die direkte RNA-Bindung von pUL69, im Gegensatz zu den homologen Proteinen, keine Voraussetzung für die RNA-Exportaktivität dieses Proteins darstellt. Um die in vivo-Bedeutung von pUL69 für die virale Replikation zu untersuchen, wurde ein UL69-defizientes HCMV konstruiert. Die Expressionsanalyse repräsentativer Gene der initialen, frühen oder späten Phase des Replikationszyklus zeigte, daß pUL69 vor allem eine Rolle für die Expression von späten Genen spielt. Die RNA-Transkripte dieser späten Gene stellen möglicherweise, ähnlich wie bei ICP27 und EB2, Ziele des pUL69-vermittelten RNA-Exports dar