Molecular analysis of a synthetic Tetracycline dependent RNA regulator

Das über in vitro Selektion gefundene Tc-bindende RNA-Aptamer kann zur Tc-abhängigen Regulation der Translation in Hefe eingesetzt werden. Dazu muß das Aptamer in den 5´-UTR eines Reporters inseriert werden. Zugabe von Tc führt dann zur Inhibierung der Translation, indem der Tc-Aptamer Komplex das Ribosom entweder an der Erkennung der cap-Struktur oder am scanning hindert. In dieser Arbeit wurde das Bindungsverhalten von Tc an Aptamer-RNA biochemisch und thermodynamisch charakterisiert. Anhand von analytischen Gelfiltrationsexperimenten konnten die äquimolare Stöchiometrie des Komplexes und die konformationelle Homogenität der Aptamer-RNA gezeigt werden. Der Tc-RNA Komplex wurde durch native PAA-Gelelektrophorese visualisiert. Dazu wurde ausgenutzt, dass die Fluoreszenzintensität von Tc bei Anregung mit 370 nM UV-Licht beim Übergang in eine hydrophobe Umgebung stark ansteigt. Dieses intrinsische Verhalten von Tc ermöglichte es, die Dissoziationskonstante des Komplexes auf 0,73 nM zu bestimmen. Hierbei handelt es sich um eine außergewöhnlich starke Bindung. Vertiefende Analysen durch isothermale Titrations-Kalorimetrie (ITC) zeigen ein ungewöhnliches Bindungsverhalten mit einem starken enthalpischen Beitrag und hoher negativer Entropie. Die hohe Bindungsenthalpie weißt auf die Ausbildung zahlreicher neuer Bindungen hin. Die ungünstige Entropie zeigt eine Versteifung des Komplexes sowie die Fixierung kleinere Moleküle wie Tc und Mg2+. Diese Schaffung von Ordnung überwiegt die bei Bindungsreaktionen normalerweise auftretende Entropieerhöhung, die durch das Freisetzen von H2O bedingt ist. Die Analyse der Punktmutanten A09G, A13U und A50U zeigte einen drastischen Affinitätsverlust. Diese Positionen befinden sich in zwei voneinander unabhängigen Bereichen des Aptamers, welche die Tc-Bindetasche formen. Einer der beiden Bereiche allein ist dazu nicht in der Lage. ITC-Experimente ergaben für A13U und A50U, dass der hohe Affinitätsverlust von einer reduzierten Bindungsenthalpie begleitet wird, was auf den Verlust von mehreren Tc-RNA Kontakten hinweist. Im Falle von A50U zeigt der komplette Verlust des entropischen Terms, dass der Komplex deutlich weniger stark strukturiert ist. Dies weist auf eine „stacking interaction“ dieses Nukleotids mit den benachbarten Purinen hin, die bei der Mutante gestört ist. Der von der Mutation A09G erzeugte entropische Einbruch zeigt, dass hier mehr Bindungsenergie für die RNA-Faltung aufgewendet werden muss. Die Position A09 ist somit für die Vorstrukturierung der RNA von großer Bedeutung. Die Analyse des Bindungsverhaltens von mehreren RNA-Tc-Derivat-Paaren mittels der „double mutant cycle“ Methode ergab, dass die R6b OH-Gruppe von Tc mit dem Adenin an Position 13 in direkten Kontakt steht. Desweiteren bildet auch die R2 Amid-Gruppe am Tc einen direkten Kontakt zum Aptamer aus. In einem zweiten Projekt wurde versucht, das Tc-Aptamer zur Tc-abhängigen Spleißregulation einzusetzten. Dazu wurden 5´-Spleißstelle (SS) und Verzweigungspunkt in das Aptamer inseriert und in das Hefe Aktin-Intron integriert. In vitro Spleißexperimente zeigten jedoch, dass die Maskierung von 5´-SS bzw. Verzweigungspunkt bereits in Abwesenheit von Tc zur völligen Inhibierung der Spleißreaktion führen.The tetracycline (tc)-binding RNA-aptamer was originally discovered by in vitro selection and can be employed for tc-dependent regulation of translation in yeast. Therefor the aptamer has to be inserted into the 5´-UTR of a reporter. Addition of tc leads to inhibition of translation by interference of the tc-aptamer complex with the formation of the 80S ribosom either by prevention of binding of the small ribosomal subunit to the cap-structure or by blocking the scanning process. The mode of tc-binding to the aptamer-RNA has been characterised in a biochemic and thermodynamic way. In analytical gelfiltration experiments the equimolar stoichiometry of the complex and the conformational homogeneity of the aptamer-RNA could be shown. The visualization of the tc-RNA complex was performed by native PAA gelelectrophoresis. For this purpose the intrinsic behaviour of tc to exhibit an increase in fluorescence upon transition into a hydrophobic environement was employed. This allowed the determination of the dissociation constant of 0.73 nM which indicates a remarkably strong binding. In-depht analysis was performd via isothermal titration calorimetry (ITC) and revealed a extraordinary binding behaviour with both a strong enthalpic and a negativ entropic contribution. The strong binding enthalpy points toward the formation of many new bonds. The unfavourable entropic contribution reflects a stiffening of the complex and the fixation of small molecules like Mg2+ and tc. This creation of order outnumbers the entropic increase which is usually caused by the release of H2O during binding reactions. Analysis of the point mutations A09G, A13U and A50U revealed a great loss in affinity. These positions are localized in two separate parts of the aptamer which are responsible for the formation of the tc-binding pocket. One single half is not able to bind tc. ITC experiments showed that the loss of affinity in the case of A13U and A50U is accompanied by a reduced binding enthalpy, indicating the loss of several tc-RNA contacts. In the case of A50U the complete disappearence of the unfavourable entropic term shows that the complex is much less structured. This points toward a stacking interaction of A50 with the adjacent purines, which is disturbed in the A50U mutant. In the case of A09G the entropic term is much more unfavourable than in the wildtype, showing the increased need of binding energy for RNA-folding. Double mutant cycle analysis revealed a direct contact between the tc R6b OH-group and the adenine at position 13. A further direct contact to the aptamer is formed by the R2 amide group of tc. In a second project we tried to utilise the aptamer for tc-dependent regulation of splicing. To do so, 5´-splice site and branchpoint, respectively, were integrated into the aptamer sequence and inserted in the yeast actin intron. In vitro splicing experiments showed that the masking of 5´-splice site or branchpoint cause the complete inhibition of the splicing reaction even in the absence of tc