Directed evolution of the \(\textit {Aspergillus niger}\) epoxide hydrolase

Die Arbeit befasst sich mit der genetischen Optimierung einer Epoxidhydrolase aus Aspergillus niger zur Erhöhung der Enantioselektivität in der hydrolytischen kinetischen Racematspaltung von Glycidylphenylether. Die Enzymvarianten wurden mittels der kombinatorischen Mutagenesestrategie CAST (Combinatorial Active-Site Saturation Test) erzeugt und durch ein auf Substratgiftigkeit basierendem Selektionssystem und eine auf Massenspektrometrie basierende Hochdurchsatzscreenings-Methode evaluiert. Eine Enzymvariante mit einem Selektivitätsfaktor E höher als 115 wurde nach 6 Generationen des Evolutionsprozesses identifiziert, was eine Verbesserung um den Faktor 25 gegenüber dem Wildtyp-Enzym bezüglich des Modellsubstrats darstellt. Um die Kenntniss der Proteinsstruktur sowie Funktion zu vertiefen, wurden detaillierte Untersuchungen, unter anderem die Bestimmung der kinetischen Parameter, das Substratspektrum, der Einfluß einzelner Mutationen und der Rückbau im Lauf der Diss. durchgeführt