Desenvolupament de noves estratègies per generar cèl·lules productores d'insulina

[cat] La diabetis tipus I és una malaltia autoimmune que resulta de la destrucció de les cèl·lules β pancreàtiques i es caracteritza per alts nivells de glucosa en sang. El control de la glucèmia gràcies a l'administració d'insulina exògena no és sempre precís i no evita les complicacions secundàries que ocasiona la malaltia. En la recerca en diabetis, s'està apostant fort per la reprogramació cel·lular amb l’objectiu de generar noves cèl·lules productores d’insulina a partir d'altres tipus cel·lulars. En els darrers anys, s’ha estat treballant en la generació de cèl·lules β substitutes a partir de cèl·lules mare o pluripotents induïdes iPSC (protocols de diferenciació dirigida) i en la reprogramació directa de cèl·lules somàtiques d’altres llinatges cap a cèl·lula productora d’insulina (protocols de transdiferenciació). En aquesta tesi, hem volgut desenvolupar noves estratègies per generar cèl·lules productores d’insulina mitjançant aquestes dues aproximacions. L’estructura de la cromatina pot esdevenir un escull important per aconseguir la diferenciació terminal (i maduresa funcional) de les cèl·lules productores d’insulina generades tant en protocols de diferenciació dirigida com en protocols de reprogramació directa. La metilació de les histones és una de les modificacions posttraduccionals de les histones més estudiada. Concretament, la trimetilació de la lisina 27 de la histona 3 (H3K27me3) és una marca repressora molt important durant el desenvolupament. Alteracions d’aquesta marca en gens de diferenciació claus podria estar relacionat amb la immaduresa de les cèl·lules β obtingudes en protocols. D’altra banda, resultats previs del grup havien demostrat que l’activitat transdiferenciadora de Neurogenina3 (Ngn3), factors de transcripció (FT) clau pel desenvolupament de les cèl·lules endocrines durant la embriogènesis, s’associava a la pèrdua de H3K27me3 en zones promotores de gens diana d’aquest factor. Totes aquestes evidències ens van portar a postular, en la primera part de la tesi, que la modulació de l’activitat de les proteïnes modificadores de la cromatina reguladores de la marca H3K27me3 podria servir per a millorar l’activació del programa endocrino-pancreàtic en un protocol de diferenciació dirigida descrit. Per altra banda, la transdiferenciació implica la conversió directa d'un tipus cel·lular en un altre sense passar per un estadi pluripotent, reduint el perill de tumorogènesis que té associat l’ús de cèl·lules pluripotents. Durant aquest procés, el programa de desenvolupament natural s’activa mitjançant FTs específics de la cèl·lula destí. Aquests FT necessiten establir una xarxa transcripcional nova similar al de la cèl·lula que es vol obtenir. S'ha vist que la activació de la xarxa transcripcional endocrina regulada per la presència de FT claus de llinatge endocrí pot promoure la conversió de cèl·lules somàtiques a cèl·lules β pancreàtiques. El Dr. Melton va ser el primer en veure com la introducció de 3 FT claus en el desenvolupament de la cèl·lula β Pdx1, Ngn3 i MafA (PNM) en les cèl·lules exocrines dóna lloc a cèl·lules productores d’insulina. Posteriorment, altres investigadors han aconseguit obtenir cèl·lules productores d’insulina a partir d’altres tipus cel·lulars, com cèl·lules ductals, hepàtiques, intestinals o estomacals mitjançant la mateixa combinació de FTs. Totes aquestes cèl·lules comparteixen un origen embrionari proper amb les cèl·lules β pancreàtiques permetent que mantinguin una certa relació en el perfil d’activitat gènica. Però la dificultat per l’obtenció d’aquestes cèl·lules fa que sigui una aproximació inviable per ús terapèutic. Fet que fa plantejar-nos en la necessitar de buscar una font cel·lular alternativa, de fàcil obtenció i capaç de generar noves cèl·lules β com el fibroblast. En la segona part de la tesi, hem investigat estratègies de reprogramació directa basades en la introducció d’un grup reduït de FT per convertir fibroblasts humans cap a cèl·lules productores d’insulina.[eng] Loss of insulin-producing β-cells causes diabetes. Cell replacement therapies have emerged as promising alternatives to daily insulin injections for treatment of diabetic patients. At the moment, Scientifics has been working on the generation of β-substituted cells from stem cells or pluripotent induced iPSC (differentiation protocols) or from adult specific cells (transdifferentiation protocols). In this thesis, I developed new strategies for generating insulin-producing cells through these two approaches. The structure of chromatin can become an important point to achieve terminal differentiation (and functional maturity) of insulin-producing cells generated both in targeted differentiation protocols and in transdifferentiation protocols. Specifically, trimethylation of lysine 27 of histone 3 (H3K27me3) is a very important repressive mark during development. Alterations of this mark in key differentiation genes could be related to the immaturity of β cells obtained in protocols. In the first part of this thesis, I described that the modulation of the activity of the regulating chromatin-modifying proteins of the H3K27me3 mark could serve to improve the activation of the endocrine-pancreatic program in a described differentiation protocols. Direct reprogramming of somatic cells bypassing a pluripotent state has emerged as an alternative pathway to stem cells to generate clinically relevant cell types for cell replacement therapies. From a therapeutic standpoint, the choice of cell source for generation of replacement cells is pivotal. Skin fibroblasts are a good option as they are easily accessible and further permit autologous transplantation. To date, the few reported attempts to generate β-like cells from skin cells have been unsatisfactory. In the second part of this thesis I designed a reprogramming protocol based on the introduction of 5 transcription factors specific to the beta cell (β-TFs) into skin fibroblasts that is able to activate key β cell genes and down-regulate the fibroblast transcriptional program in human fibroblasts. Furthermore, I showed that the converted fibroblasts exhibit functional characteristics similar to β cells both in vitro and in vivo. These findings provide a proof-of-concept and the molecular basis for a new path to generate β-like cells for cell replacement strategies to treat insulin-dependent diabetes