Use of HPLC/ED to monitoring some clinically important sulphur compounds

Cílem této práce bylo (a) vyvinout vhodnou metodu pro stanovení endogenních hladin kyseliny lipoové, (b) ověřit, zda je tato metoda vhodná i pro stanovení hladin kyseliny lipoové po suplementaci, (c) určit cytotoxicitu kyseliny lipoové na erytrocyty, (d) ověřit význam homocysteinu jako biomarkeru v klinické praxi, získat obecný přehled o celkovém metabolismu methioninu u pacientů s onemocněním koronárních arterii a ověřit okamžitý vliv perkutánní koronární intervence na hladiny methioninu a jeho metabolitů. (a) Cílem bylo vyvinout vhodnou metodu pro stanovení hladin volné kyseliny lipoové. Jedná se o vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii s elektrochemickou detekcí. Vzorky krve byly získány od 40 dobrovolných darců, kteří splňovali podmínky pro zapsání do registru dárců. Tito dárci nebyli suplementováni kyselinou lipoovou. Při stanovení kyseliny lipoové v plasmě byly vzorky krve odstředěny a získaná plasma byla deproteinována acetonitrilem. Po odstředění následovala extrakce na pevné fázi a kyselina lipoová byla eluována z kolonky methanolem. Eluát byl odpařen do sucha v atmosféře dusíku. Odparek byl rozpuštěn ve směsi acetonitrilu a deionizované vody, po filtraci byl vzorek dávkován na analytickou kolonu s vázanou reverzní fází. Limit detekce a kvantifikace této metody byl 1,85 a 5,18 nmol/l. Dosáhli jsme nižší hodnoty meze detekce v porovnání s předchozími studiemi (2,4 a 4,9 nmol/l), které se zabývaly stanovením volné kyseliny lipoové u nesuplementovaných jedinců. Nicméně. i přesto jsme hladiny kyseliny lipoové v plasmě u všech 40 dobrovolných dárců nedetekovali. Výsledky naší studie ukazuji, že endogenní koncentrace volné kyseliny lipoové v plasmě jsou pravděpodobně nižší než 1,85 nmol/l. (b) Tato metoda byla využita k ověření hladin kyseliny lipoové v plasmě. u suplementovaných dobrovolných dárců a je tak vhodná pro studie zabývající se stanovením hladin kyseliny lipoové u suplementovaných pacientů. (c) Byl sledován vliv kyseliny lipoové na životaschopnost (viabilitu) erytrocytů. Vzorky krve byly získány od dobrovolných nesuplementovaných dárců. Krev byla odstředěna při 750 x g, separované erytrocyty byly celkem 3x promyty fosfátovým pufrem, následně naředěny Ringerovým roztokem a dávkovány do 12jamkových kultivačních destiček. K suspenzi erytrocytů byly přidány různě naředěné roztoky kyseliny lipoové. Inkubace probíhala 24 a 48 hodin při 37 °C. K stanoveni viability buněk byla použita metoda vylučovaní trypanové modři. Námi testované koncentrace kyseliny lipoové (1, 5 a 10 μmol/l) nezpůsobily ani po 48hodinové inkubaci statisticky významné změny ve viabilitě ani počtu erytrocytů oproti kontrole. Také žádná z testovaných vysokých koncentrací (50, 100, 250 μmol/l) kyseliny lipoové nezpůsobila statisticky významné změny ve viabilitě erytrocytů. Na počet erytrocytů měly vysoké koncentrace statisticky významný vliv již po 24hodinové inkubaci. (d) Hladiny celkového homocysteinu, cysteinu, methioninu a cysteinyl-glycinu v plasmě byly stanoveny metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s coulometrickou detekci. Důvodem byla rychlá příprava vzorku bez nutnosti derivatizace a nižší finanční nároky oproti jiným metodám. Vzorky krve byly získány od 68 pacientů s prokázaným onemocněním koronárních artérii, kteří byli rozděleni do tří skupin dle stupně závažnosti onemocnění. Nebyly nalezeny žádné statisticky významné rozdíly v prevalenci diabetu, pre-diabetu a onemocnění ledvin mezi sledovanými skupinami, rovněž mezi kuřáky, nekuřáky i pacienty s normálním a zvýšeným krevním tlakem. Byly zjištěny signifikantní rozdíly v hladinách albuminu, celkového cholesterolu, LDL-cholesterolu a stupně indexu aterogenity u sledovaných skupin pacientů. Byly zjištěny statisticky významně zvýšené hladiny homocysteinu u pacientů s akutní formou onemocnění v porovnání s pacienty trpící chronickou formou tohoto onemocnění. Naše výsledky podporují hypotézu, že homocystein nelze využít pro včasnou diagnostiku stenózy v koronárních arteriích, ale zdá se, že by mohl být dobrým biomarkerem závažnosti již prokázaného onemocnění koronárních artérií. Zvýšené hladiny homocysteinu korelují s nestabilitou onemocnění a nutností léčby. U pacientů, u nichž došlo k dokončení revaskularizace, statisticky významně poklesly hladiny cysteinu, cysteinyl-glycinu a methioninu před druhou intervencí v porovnání s pacienty mající akutní a chronickou formu onemocnění. Tento stav je pravděpodobně spojen se zvýšeným oxidačním stresem, kdy je preferována transsulfurační dráha, která zvyšuje spotřebu cysteinu. Zdá se tedy, že cystein hraje důležitou úlohu v organismu jako antioxidant než jako rizikový faktor u pacientů s onemocněním koronárních artérií. Z této skupiny pacientů bylo vybráno 44 pacientů, u kterých následovala po angiografii perkutánní koronární intervence. Vzorky krve byly odebírány ve třech časových bodech, před zákrokem, 24 a 48 hodin po intervenci. Nebyly nalezeny žádné statisticky významné rozdíly v hladinách homocysteinu a cysteinu před zákrokem, 24 a 48 hodin po zákroku. Hladiny methioninu a cysteinyl-glycinu byly signifikantně vyšší 24 a 48 hodinách po intervenci ve srovnání s hladinami před zákrokem.The aims of this thesis are: (a) the development of a suitable method for the determination endogenous levels of lipoic acid, (b) the verification of a possibility to use the method for determining the lipoic acid levels after supplementation, (c) the determination of lipoic acid cytotoxicity for erythrocytes, and (d) to verify the importance of homocysteine as a biomarker in clinical practice. Moreover, the aim is to obtain a general overview about the whole methionine metabolism for patients, suffering from coronary artery disease at different degrees of severity, as well as?n to verify the immediate effect of a percutaneous coronary intervention on the methionine level and its metabolites. (a) The aim was to develop a suitable method in order to determine the endogenous levels of free lipoic acid using a high-performance liquid chromatography method with a very sensitive coulometric detection. Plasma samples were collected from 40 voluntary blood donors. This group was non-supplemented with lipoic acid and met the preconditions in for being included to the blood donorsˇ? registry. A blood sample was collected into a tube containing ethylene diamintetraacetic acid as an anticoagulant and the obtained plasma was deproteinized with acetonitrile. A solid phase extraction was used for the extraction. The samples were eluted with methanol and the eluate was evaporated to dryness using a gentle nitrogen stream. The residue was re-dissolved in a mixture of acetonitrile/water. After filtration, the sample was injected into an analytical column with reversed-phase. The limit of detection and the limit of quantification values were 1.85 and 5.18 nmol/l. The limit of detection was better than in previous studies: 2.4 nmo/l and 4.9 nmol/l respectively. However, the levels of LA in the plasma of the 40 non-supplemented voluntary blood donors were not detectable in all cases. The results of our study show that endogenous concentrations of LA are less than1.85 nmol/l. (b) This method was used in order to determine lipoic acid levels in the plasma of supplemented voluntary blood donors. This method is suitable for further studies in order to determine lipoic acid levels in patients after supplementation. (c) The effect of lipoic acid on the viability of erythrocytes was monitored. Plasma samples were collected from voluntary blood donors, non-supplemented with lipoic acid. The venous blood was centrifuged at 750 x g; the separated erythrocytes were washed three times with phosphate buffer, diluted with Ringer's solution, and injected into 12-well culture plates. Lipoic acid solutions, which had previously been diluted in different rations, were added to the erythrocyte suspension. The incubation time was 24 and 48 hours at 37˘XC. For the determination of the cell viability the Tryphan blue exclusion test was used. The concentrations of lipoic acid (1.5 and 10 Łgmol/l) did not cause a statistically significant change regarding the viability or number of erythrocytes after the 24 and 48-hour incubation time. The high concentrations of lipoic acid (50, 100, 250 Łgmol/l) did neither cause a statistically significant change regarding the viability or the number of erythrocytes after the 24 and 48 hour incubation time. On the other hand, the high concentrations of lipoic acid had a statistically significant effect on the number of erythrocytes already after the 24-hour incubation time. (d) We measured the total plasma level of homocysteine, cysteine, methionine and cysteinyl-glycine using high-performance liquid chromatography with coulometric detection. Blood samples were obtained from 68 patients, suffering from coronary artery disease. The patients were divided into three groups according to the severity of their disease. We did not find any significant differences in the prevalence of diabetes, pre-diabetes and kidney diseases between the selected groups. We did not find any significant differences between the number of smokers and hypertonic patients. We found significant differences between the levels of albumin, total cholesterol, LDL-C and the index of atherogenity in the selected groups. The levels of homocysteine at those patients with acute coronary artery disease were significantly higher compared to the chronically ill patients. Our results support the hypothesis that total plasma of homocysteine is not useable in early diagnostic of stenosis in coronary arteries but seem to be a good biomarker of the severity of proved disease. Homocysteine increases with an instability of the disease and a need for treatment. Those patients who returned for the completion of the re-vasculization had significantly decreased levels of the total amount of plasma cysteine, cysteinyl-glycine and methionine before the second intervention, compared to those patients with an acute or chronic form of the disease. The condition before completion of the re-vasculization is probably associated with higher oxidative stress, when the transsulfuration pathway is preferred, because it increases cysteine consumption. The cysteine seems to act more as an antioxidant than a risk factor in patients with coronary artery disease. 44 patients underwent a coronary angiography and subsequently a percutaneous coronary intervention. The sample collections took place before the intervention and control samples were taken 24 and 48 hours after the intervention. We have not found any statistical differences between the levels of homocysteine and cysteine before and 24 hours and 48 hours after the intervention. The levels of methionine and cysteinyl-glycine were significantly higher 24 hours and 48 hours after the percutaneous coronary intervention compared to concentrations before the intervention.Fakulta chemicko-technologick