Optimization of Culture Conditions of Hepatocyte in Primary Culture

Tato diplomová práce byla zaměřena na optimalizaci kultivačních podmínek hepatocytů v primární kultuře s ohledem na densitu buněk a dobu potřebnou pro přichycení buněk k povrchu mikrotitračních destiček (tzv. dobu seedingu). Primární kultury hepatocytů jsou používány pro toxikologické a farmakokinetické studie, pro studium metabolismu a genové exprese. Životaschopnost kultivovaných buněk a míra jejich poškození byla hodnocena pomocí aktivity buněčných dehydrogenáz (WST-1 test), aktivity laktátdehydrogenázy (LDH), resp. LDH-leakage, a aktivity kaspázy 3. Nejprve byla optimalizována densita buněk pro vybrané typy mikrotitračních destiček. Z výsledků vyplývá, že optimální density jsou 30 000 bb/j pro 96jamkové destičky, 200 000 bb/j pro 24jamkové destičky a 350 000 bb/j pro 12jamkové destičky. Tyto hodnoty odpovídají přibližně densitě 1,0×105 bb/cm2. Druhým úkolem bylo optimalizovat dobu potřebnou pro přichycení buněk k povrchu kultivačních destiček. Bylo zjištěno, že testované doby nemají vliv na hodnocené parametry hepatocytů.The thesis was focused on optimization of hepatocyte culture conditions in primary culture considering cell density and seeding time. Primary hepatocyte cultures are used for toxicological and pharmacokinetic studies, for the study of metabolism and gene expression. The viability of cultured cells and their damage rate was determined by cellular dehydrogenases activity (WST-1 test), lactate dehydrogenase activity (LDH), respectively LDH-leakage, and activity of caspase 3. At first, cell density for different well plate types was optimized. The results indicate that optimum densities are 30 000 cells/well for 96-well plates, 200 000 cells/well for 24-well plates and 350 000 cells/well for 12-well plates. These values correspond to a density 1,0×105 cells/cm2. Another aim of this work was to optimize the time of seeding. It was found that tested seeding times do not affect the evaluated parameters of hepatocytes.Fakulta chemicko-technologická1. Prezentace výsledků diplomové práce. 2. Diskuze k posudku vedoucího a oponenta diplomové práce. 3. Studentka zodpověděla všechny dotazy a připomínky k DP