Visual behavior of zebrafish

For biomedical research, adequate model organisms are of vital importance. For the investigation of the visual system, zebrafish have proven to be of outstanding value. Although they do not belong to the mammalian class, their cone-dominated retina, in combination with the extracorporal, rapid development of the transparent embryos, the large number of offspring and the short generation time represents a major advantage over the widely used mouse model. A basic requirement for the identification and characterization of subjects with visual defects are robust behavioral tests. For larval fish, a number of behavioral assays have been developed and were successfully employed in large-scale, forward genetic screens to identify numerous mutations affecting the development of the visual system. In contrast, behavioral tests for the visual system of adult fish are largely missing. A behavioral test which proved especially valuable for larval fish is the optokinetic response assay. In this test of visual performance, the subject is presented a horizontally moving pattern. This movement elicits stereotyped eye movements, which can be recorded and analyzed in an automated manner. In my thesis, I adapted this assay for adult fish (Chapter 3) and used it to assess the visual performance of adult albino fish. We found that strong albino alleles causing a lack of pigmentation in the retinal pigment epithelium go along with a reduction in visual acuity, while contrast sensitivity is unaffected. In contrast, weaker albino alleles only affect body pigmentation, while leaving the retinal pigmentation intact. Homozygous carrier fish of these alleles did not show any difference in visual performance compared to wild-type fish (Chapter 6). In addition, I refined the existing setup for larval fish, allowing for simultaneous presentation of the visual stimulus to both eyes and for more flexibility of stimulus properties (Chapter 2). This system was then used to behaviorally determine the visual acuity of zebrafish larvae and compare these results with the theoretical maximal value calculated from photoreceptor spacing. As it proved out, visual acuity in larval fish is mainly, but not completely limited by photoreceptor spacing (Chapter 4). Furthermore, I characterized visual performance of larval fish carrying a mutation in the gene coding for Cadherin 23. Mutations in the ortholog gene lead to Usher syndrome type I in human patients, a hereditary disease characterized by deafness from birth and an early onset of photoreceptor degeneration. In the zebrafish model, however, I was not able to detect any visual defects (Chapter 5). The robustness and flexibility of the optokinetic response system convinced TSE Systems GmbH, a company specialized in the production of in-vivo animal research instrumentation, to establish a partnership and to re-design and commercialize the setup (Chapter 7). To complement this assay, which relies on motion vision and therefore is not adequate to e.g. investigate color vision, I developed a system for fully automated operant conditioning of adult zebrafish to visual stimuli, a system which can not only be used to study various aspects of visual, but also of cognitive function (Chapter 8). In addition, I implemented a setup for the evaluation of the visual motor response in larval zebrafish. This setup simultaneously records the locomotor activity of up to 96 individual zebrafish larvae in response to changes of the illumination. This system was used together with other behavioral assays to characterize visual function of noir mutants. These larvae carry a mutation in the gene coding for a subunit of the pyruvate dehydrogenase complex. This mutation affects cellular energy metabolism in general, and photoreceptors slowly degenerate due to their high energy demand. However, the first cells to be affected 5 are cholinergic amacrine cells, which fail to synthesize their neurotransmitter acetylcholine. This failure leads to a selective loss of motion vision, while general light perception is still present (Chapter 10). In Chapter 11, finally, I investigated the influence of visible and ultraviolet light on the body pigmentation of larval zebrafish. Pigment distribution in the skin of zebrafish larvae adapts to the color of the background, and it has been proposed that this process, termed visual background adaptation, serves a camouflage function to avoid visual detection by predators. Since I found that pigment dispersion in dermal melanophores is very efficiently triggered by ultraviolet light, I propose an additional, so far unappreciated function of melanophores in larval zebrafish: the protection against ultraviolet irradiation. Für die biomedizinischen Forschung sind adäquate Modellorganismen von entscheidender Bedeutung. Zebrafische haben sich für die Erforschung des visuellen Systems als besonders geeignet erwiesen. Obwohl sie keine Säugetiere sind, stellt ihre von Zapfen dominierte Netzhaut in Kombination mit der schnellen Entwicklung der transparenten Embryonen ausserhalb des Mutterleibs, der grossen Anzahl Nachkommen und der kurzen Generationszeit einen bedeutenden Vorteil gegenüber dem oft verwendeten Mausmodell dar. Für die Identifikation und Charakterisierung von Tieren mit einem visuellen Defekt sind robuste Verhaltenstests unabdingbar. Für Fischlarven wurde eine Anzahl von solchen Verhaltenstests entwickelt und in gross angelegten genetischen Screens erfolgreich verwendet, um zahlreiche Mutationen, welche die Entwicklung des Sehsystems beeinflussen, zu identifizieren. Für die Erforschung des visuellen Systems von adulten Fischen hingegen sind praktisch keine Verhaltenstests etabliert. Ein Verhaltenstest welcher sich für die Erforschung des Sehsystems von Fischlarven als besonders wertvoll erwiesen hat, ist ein Test des optokinetischen Reflexes. Bei diesem Test wird dem Versuchstier ein sich horizontal bewegendes Muster präsentiert. Diese Bewegung löst stereotype Augenbewegungen aus, welche automatisch erfasst und analysiert werden können. In meiner Doktorarbeit habe ich diesen Verhaltenstest für adulte Fische adaptiert (Kapitel 3) und angewandt um das Sehvermögen von adulten albino Fischen zu untersuchen. Wie sich herausgestellt hat, führen starke albino Allele zu einem Fehlen von Pigmenten im retinalen Pigment Epithel, was mit einer Reduktion der räumlichen Auflösung einhergeht. Die Kontrastempfindlichkeit bleibt jedoch unverändert. Schwächere Allele hingegen haben nur einen Einflusss auf die Körperpigmentierung, während die Pigmentierung im retinalen Pigment Epithel intakt bleibt. Homozygote Träger dieser Allele zeigen keine Veränderung des Sehvermögens gegenüber wildtyp Fischen (Kapitel 6). Zudem habe ich die bereits existierende Apparatur für Fischlarven weiterentwickelt, was nun die simultane Stimulation beider Augen erlaubt, sowie eine grössere Flexibilität beim visuellen Stimulus zulässt (Kapitel 2). Dieses System wurde dann benutzt, um die räumliche Auflösung von Zebrafischlarven zu bestimmen und diesen verhaltensbasierten Wert mit dem theoretisch maximalen Wert, welcher aus dem Abstand der Photorezeptoren errechnet wurde, zu vergleichen. Wie sich herausgestellt hat, wird die maximale räumliche Auflösung von Zebrafischlarven hauptsächlich, aber nicht ausschliesslich vom Abstand der Photorezeptoren limitiert (Kapitel 4). Zusätzlich wurde mit dem System das Sehvermögen von Fischlarven ermittelt, welche eine Mutation in einem Gen tragen, welches für das Protein Cadherin 23 kodiert. Beim Menschen führen Mutationen im orthologen Gen zum Usher Syndrom Typ I, eine Erbkrankheit welche sich durch Taubheit von Geburt an, sowie eine früh einsetzende Degeneration der Photorezeptoren auszeichnet. Im Zebrafischmodell konnte ich jedoch keine Defekte des visuellen Systems feststellen (Kapitel 5). Die Robustheit und Flexibilität des Systems hat auch TSE Systems GmbH, eine Firma welche sich auf die Produktion von in-vivo Tierversuchsinstrumenten spezialierst hat, überzeugt und dazu bewogen, in einer Partnerschaft das System weiterzuentwickeln und zu kommerzialisieren (Kapitel 7). Zur Ergänzung dieses Verhaltenstests, welcher auf Bewegungssehen basiert und deshalb nicht geeignet ist um beispielsweise Farbensehen zu untersuchen, habe ich ein System entwickelt, welches eine vollautomatische operante Konditionierung von adulten Zebrafischen auf visuelle Stimuli erlaubt. Dieses System kann 7 nicht nur zur Untersuchung verschiedener Aspekte der visuellen, sondern auch der kognitiven Funktion verwendet werden (Kapitel 8). Zusätzlich habe ich ein System für die Untersuchung der visuellen motorischen Antwort von Zebrafischlarven implementiert. Dieses System erlaubt die simultane Analyse der lokomotorischen Aktivität von bis zu 96 Zebrafischlarven in Abhängigkeit von Veränderungen der Beleuchtung. Dieses System wurde, zusammen mit anderen Verhaltenstests, verwendet um die visuelle Funktion von noir Mutanten zu charakterisieren. Diese Larven tragen eine Muation im Gen, welches für eine Untereinheit des Pyruvat Dehydrogenase Komplexes kodiert. Diese Mutation beeinflusst den zellulären Energiehaushalt im Allgemeinen, und Photorezeptoren sterben aufgrund ihres hohen Energiebedarfs langsam ab. Die ersten Zellen welche betroffen sind, sind jedoch die cholinergen Amakrinzellen, welche ihren Neurotransmitter Acetylcholin nicht mehr synthetisieren können. Dies führt zu einem selektiven Verlust des Bewegungssehens, während die Lichtwahrnehmung im Generellen noch vorhanden ist (Kapitel 10). In Kapitel 11 habe ich schliesslich den Einfluss von sichtarem und ultraviolettem Licht auf die Körperpigmentierung von Zebrafischlarven untersucht. Die Verteilung der Pigmente in der Haut von Zebrafischlarven passt sich der Farbe des Hintergrunds an, und es wurde vorgeschlagen, dass dieser Prozess, genannt visuelle Hintergrundsadaptation, einer Tarnfunktion dient, d.h. dass die Fischlarve dadurch vermeidet, von Fressfeinden entdeckt zu werden. Aufgrund meiner Beobachtung, dass die Pigmentverlagerung sehr effizient durch ultraviolettes Licht gesteuert wird, schlage ich eine zusätzliche, bis jetzt unbeachtete Funktion der Körperpigmentierung bei Zebrafischlarven vor: den Schutz vor ultravioletter Strahlung