Upregulation of neprilysin as a potential therapeutic approach in Alzheimer's disease

SUMMARY Alzheimer’s disease (AD) is the major cause of dementia and cognitive impairments among older people and affects more than 30% of the population above 85 years of age. It is an age dependent neurodegenerative disease histopathologically characterized by the deposition of extracellular β-amyloid (Aβ) plaques and the formation of intracellular neurofibrillary tangles composed of the hyperphosphorylated protein tau. Converging evidence links abnormally high brain concentrations of Aβ, due to a shift in the balance between Aβ production and degradation, to the pathology of AD and to cognitive deficits in transgenic mouse models. It was previously found in our lab that injection of synthetic fibrillar Aβ1-42 into mouse brains caused sustained increases in brain levels of neprilysin protein and led to dramatic reduction of brain Aβ level, as well as prevention of amyloid plaque formation and associated cytopathology. Because of an increase of neprilysin mRNA observed 20 weeks after injection, we investigated the potential regulation of neprilysin expression by Aβ1-42 in vitro using a luciferase assay driven by one of the three neprilysin promoters and incubation of 293T and SH-SY5Y cells with aggregated Aβ1-42, aggregated Aβ42-1 or PBS. Aβ1-42 incubation did not affect neprilysin promoter activity in vitro. However, all trans retinoic acid (RA) which is used to differentiate SH-SY5Y cells, was shown to increase the activity of all three neprilysin promoters during SH-SY5Y differentiation. A similar effect was also found in 293T cells and led to an increase of neprilysin protein levels. Diffusible factors associated with microglia activation did not affect activity of neprilysin promoters in vitro and were not responsible for the upregulation of neprilysin observed in vivo after Aβ1-42 injection. Analysis of a new group of mice, 20 weeks after similar brain injection of aggregated Aβ1-42, Aβ42-1 or PBS confirmed the Aβ1-42-related upregulation of neprilysin protein level but did not show any increase of total neprilysin mRNA level and promoter specific mRNA levels when compared to Aβ42-1 injected mice, suggesting that increased protein stability may also be involved in the Aβ1-42-related upregulation of neprilysin in vivo. Searching for other Aβ-degrading pathways, we also found that brain injection of aggregated Aβ1-42 led to the activation of the plasminogen system. The activity of plasmin, another Aβ degrading enzyme, was increased 20 weeks after intracranial injection of Aβ1-42 when compared to mice which received injection of Aβ42-1 or PBS. Activation of plasmin was found to be associated with an increased activity of urokinase plasminogen activator (uPA), 9 which did not involve transcription regulation since uPA mRNA level was unaffected. Interestingly, uPA activity strongly correlated with neprilysin protein level after Aβ1-42 injection. Therefore, we investigated the possible association between both increases. Aβ1-42 efficiently increased the activity of both plasminogen activators, uPA and tissue-type plasminogen activator (tPA) on different cell types including primary neuronal culture. However, this increase of activity was not associated with upregulation of neprilysin. On the contrary, transgenic overexpression of neprilysin in neurons increased activity of both uPA and tPA in the brain and strongly implied that upregulation of neprilysin may act on the plasminogen system via pathways, which still need to be identified. Neprilysin is the major rate-limiting peptidase involved in the physiological degradation of Aβ in the brain and its role in amyloidosis was further investigated in vivo. We found that partial and total reduction of neprilysin level, led to murine Aβ accumulation with plaque formation without alteration of APP level in the brain. It was associated with signs of neurodegeneration in the hippocampus and cognitive deficits in the conditioned taste aversion paradigm. Mice with neprilysin deletion represent the first mouse model with endogenous murine Aβ plaque like pathology without alteration of APP processing and therefore a valuable tool to study specifically the role of endogenous Aβ. Indeed, many transgenic mice overexpressing the mutated human amyloid precursor protein (APP) were produced and recapitulated many aspects of AD pathology including Aβ amyloidosis and cognitive deficits. These models were used to evaluate therapeutic interventions for AD but could not clearly distinguish the effects related to Aβ accumulation from overexpression of APP or its other proteolytic fragments. To investigate the potential therapeutical effect of neprilysin upregulation against amyloidosis, we generated transgenic mice, overexpressing neprilysin in neurons (NEP mice) and bred them with one of these mouse models of amyloidosis overexpressing human AD-causing mutated APP in neurons (J20 mice). Neprilysin overexpression prevented the accumulation of Aβ without altering neither the APP processing nor the levels of substance P, enkephalin and somatostatin, three other major neuronal neprilysin substrates. Behavioral analysis of the NEP mice showed a significant abnormal locomotion with slight decrease of anxiety both of which disappeared with age. Except a lack of contextual fear conditioning, learning and memory performances were not affected by neprilysin overexpression, suggesting that such an upregulation would present few cognitive side effects. The hyperlocomotion, decreased anxiety and memory deficit during the conditioned taste aversion task observed in the J20 mice were not prevented by neprilysin 10 overexpression suggesting that either the beneficial effects of neprilysin was limited or APP and its other proteolytic fragments which were not modified by neprilysin overexpression are responsible for these behavioral alterations. However, neprilysin overexpression prevented the memory impairment observed in J20 mice during the Morris water maze task, strongly supporting Aβ as the culprit responsible for this cognitive impairment and neprilysin upregulation as a valid Aβ-lowering therapeutic approach for AD. 11 ZUSAMMENFASSUNG Die Alzheimer Demenz (AD) ist ein multifaktorielles Syndrom, welches durch eine progressive Atrophie und die Zerstörung von Neuronen charakterisiert ist, was zu kognitiver Schwäche, Demenz und schliesslich zum Tod führt. AD Forschung hat sich bisher hauptsächlich auf die Generierung und Ablagerung von β-Amyloidpeptiden (Aβ) konzentriert, da die abnormal hohe Aβ-Konzentration als primärer Auslöser von AD gilt. Die extrazellulären Aβ Ablagerungen (Plaques) im Gehirn begünstigen die Entstehung von neurofibrillären Läsionen, die synaptische Fehlfunktion und den Verlust von Neuronen im Gehirn der AD Patienten. Mutationen in APP (Amyloid-Precursor Protein), Presenilin (PS) 1- und 2– Genen verursachen die familiäre Form der Krankheit durch Generierung von erhöhten Mengen von Aβ. Diese Effekte werden durch das Alter verstärkt. Je länger desto mehr wird es klar, dass in den meisten Patienten eine abnormale Akkumulation von Aβ im Gehirn durch mangelhaften Abbau dieses Peptids verursacht wird. Arbeiten aus unserem Labor zeigten, dass die Injektion von fibrillärem Aβ1-42 ins Gehirn der Mäuse zu einem erhöhten Gehalt des Aβ-abbauenden Enzyms Neprilysin in Neuronen führte, was eine signifikante Reduktion der Aβ Mengen und Plaque-Pathologie zur Folge hatte. Die Erhöhung des Neprilysins wurde, unter anderem mechanistisch auf eine höhere Transkriptionsaktivität zurückgeführt. Deswegen haben wir versucht, mittels Luciferase- Assay die Aktivierung von Neprilysin Promoteren durch Aβ1-42 in vitro zu untersuchen. Dabei konnte keine Aktivierung der Neprilysin-Expression durch Aβ1-42 oder eine Beteiligung der diffusionsfähigen Faktoren gezeigt werden. Wir haben aber festgestellt, dass Retinsäure, die für neuronale Ausdifferenzierung der Neuroblastomazellen benützt wird, sich aktivierend auf alle 3 Neprilysin-Promoteren auswirkt. In weiteren in vivo Experimenten könnten wir höhere Neprilysin mRNA and Protein-Konzentrationen nicht miteinander korrelieren. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine erhöhte Proteinstabilität in vivo auch zur Erhöhung des Neprilysin-Gehalts beigetragen haben könnte. Zusätzlich zeigen wir hier, dass die Aβ Injektionen die Aktivierung von Plasmin, eines weiteren Aβ-abbauenden Enzyms, im Gehirn bewirken. Die Plasmin-Aktivierung war von einer höheren Aktivität des urokinase plasminogen activator (uPA) begleitet. uPA Transkription war jedoch unverändert. uPA Aktivität und erhöhter Neprilysin-Gehalt zeigten eine starke Korrelation in vivo. Wir untersuchten diesen Zusammenhang in vitro und konnten zeigen, dass Aβ1-42 die Aktivität 12 beider Plasminogenaktivatoren uPA und tissue-type plasminogen activator (tPA) in vitro erhöht. Auch neuronale Expression von Neprilysin in transgenen Tieren führte zur Aktivitätssteigerung von uPA und tPA in Gehirn. Neprilysin ist das wichtigste Aβ abbauende Enzym im Gehirn. Unser Ergebnisse zeigen, dass Neprilysin defiziente Mäuse eine Akkumulation und Ablagerung des Aβ Peptids im Gehirn aufweisen, ohne jedoch das Spaltungsmuster (processing) des APP Moleküls zu verändern. Neprilysin-defiziente Mäuse zeigten auch Anzeichen einer Aβ-abhängigen Neurodegeneration und kognitive Defizite. Diese Mäuse stellen das erste Modell mit muriner Aβ-Pathologie dar und ermöglichen die Untersuchung der Rolle des endogenen Aβ in Pathophysiologie von AD. Dies ist besonderes wichtig, weil die bisherigen Modelle auf der Überexpression des humanen APP in transgenen Tieren basieren. Eine Trennung der toxischen Einwirkungen von Aβ im Vergleich zur Beteiligung anderer APP-Spaltprodukte ist deswegen in diesen Modellen nicht eindeutig machbar. Um das therapeutische Potential der Neprilysin-Aktivierung gegen Aβ-Pathologie zu testen, haben wir unsere transgene Tiere mit einem Mausmodell mit erhöhter Aβ Produktion und Ablagerung (J20) gekreuzt. Wir zeigen hier, dass die Doppelmutanten eine massive Reduktion von Aβ im Gehirn aufweisen, während sich die Konzentrationen anderer APP-Spaltprodukten nicht ändern. Auch die Konzentrationen anderer Neprilysin-Substrate (Substance P, Enkephalin, Somatostatin) waren unverändert. Eine marginale Verminderung der Ängstlichkeit kennzeichnete die jungen NEP Tiere, die aber mit fortschreitendern Alter verschwand. Abgesehen davon, dass die NEP Maüse Schwirigkeiten in einem Angst-Konditionierungstest zeigten, hatte die Überexpression von Neprilysin keinen Einfluss auf die Lernfähigkeit und Gedächnisleistung. Dies denkt darauf hin, dass bei Neprilysin uberexpression wenig Beeinflussungen der cognitiven Leistungen zu erwarten wären. Sowohl die verminderte Lokomotion und Ängstlichkeit als auch die Defizite in konditionierter Geschmack-Aversion der J20 Mäuse wurde durch Neprilysin Überexpression nicht behoben. Eine mögliche Erklärung dafür könnte eine ungenügende Neprilysin-Konzentration sein, um diese Effekte rückgängig zu machen. Alternativ ist es möglich, dass APP und seine anderen Spaltprodukte, deren Gehalt nicht durch Neprilysin reduziert wird, für die oben beschriebenen Effekte verantwortlich sind. Im Gegenteil, die Überexpression von Neprilysin verhinderte die Beeinträchtigung der kognitiven Gedächtnisleistung der J20 Tiere, so dass sie von den Wildtyp Tieren nicht unterscheidbar waren. 13 Unsere Daten belegen in einem in vivo system, dass Aβ eine eigentlich toxische Spezies in der AD Pathophysiologie ist, welche die kognitiven Defizite verursacht. Weil Neprilysin- Aktivierung die Prozessierung des APP Moleküls nicht verändert, stellen wir die Hypothese auf, dass eine Hochregulation des Neprilysins die physiologischen Funktionen des APP nicht verändert. Wir schlagen deswegen eine neuronale Aktivierung des Neprilysins als eine wirkungsvolle Möglichkeit zur Aβ-Reduktion und AD-Therapie vor