Induzierte pluripotente Stammzellen - Entwicklung patientenspezifischer Zelllinien als Modellsysteme zur Erforschung von Erkrankungen des retinalen Pigmentepithels

Neben multifaktoriell bedingten Erkrankungen des Retinalen Pigmentepithels (RPE), wie der altersbedingten Makuladegeneration, die in Deutschland die häufigste und weltweit eine der Hauptursachen von Erblindungen im Erwachsenenalter darstellt, führen auch eine Reihe monogenetisch bedingter Erkrankungen des RPE zu einem progredienten Verlust der Sehkraft. Bis dato gibt es nur begrenzte therapeutische Optionen, da die molekulare Pathogenese dieser Erkrankungen oft noch unklar ist. Humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) gelten inzwischen als vielversprechende Möglichkeit in-vitro Modelle von Erkrankungen des RPE zu generieren, um die zu Grunde liegenden Ursachen näher beleuchten zu können. Die im Folgenden beschriebene Studie lieferte als Basisprojekt wichtige Erkenntnisse für eine Arbeitsgruppe, die sich am Institut für Humangenetik der Universität Regensburg (UR) mit der Erforschung von hiPSCs und daraus abgeleiteten RPE-Zellen beschäftigt. Ziel der Arbeit war in erster Linie die Etablierung einer zuverlässigen Methode zur Erzeugung unversehrter hiPSC-abgeleiteter RPE-Zelllinien sowie deren ausführliche Charakterisierung. Während die Bedingungen für eine zuverlässige Differenzierung der hiPSCs zu daraus abgeleiteten RPE Zellen am Institut für Humangenetik der Universität Regensburg (UR) erst im Rahmen dieser Arbeit analysiert und festgelegt werden mussten, war ein verlässliches Protokoll für die Reprogrammierung von Fibroblasten zu hiPSCs dort bereits im Vorfeld etabliert worden. Es konnte die erfolgreiche Reprogrammierung adulter humaner dermaler Fibroblasten zu hiPSCs und deren Differenzierung in reines passagierbares RPE gezeigt werden. Die so erhaltenen Zellen waren sowohl strukturell als auch funktionell nativen RPE-Zellen sehr ähnlich. Zunächst wurden hierfür Fibroblastenstämme aus Hautbiopsien von Kontrollpersonen und Patienten mit Mutationen im Bestrophin-1 (BEST1)-Gen gewonnen, welche für die autosomal dominante vitelliforme Makuladystrophie verantwortlich sind. Durch Transduktion mittels polyzystronischem Lentivirus und Überexpression der Faktoren OCT4, SOX2, KLF4 und L-Myc wurden die Fibroblasten zu hiPSCs reprogrammiert. Diese zeigten eine ähnliche Morphologie wie embryonale Stammzellen, wiesen auf RNA- und Proteinebene ein charakteristisches Stammzellmarkerprofil auf und besaßen chromosomale Integrität. Die nachfolgende Differenzierung lieferte hiPSC-abgeleitetes RPE, das einen pigmentierten hexagonalen Zellrasen bildete. Es war sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene mit nativem RPE vergleichbar. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten hexagonale Zellen mit typischen apikalen Mikrovilli, während die hohen transepithelialen Widerstände für Zellintegrität sowie die Ausbildung eines funktionsfähigen apikalen Tight-Junction Komplexes sprachen. Zudem bestätigten Fütterungsexperimente mit Photorezeptoraußensegmenten (POS) eine intakte Phagozytosefähigkeit des hiPSC-abgeleiteten RPE. Darüber hinaus gelang es in dieser Arbeit sowie in späteren Experimenten an den hier erzeugten Zellen nachzuweisen, dass kryokonserviertes hiPSC-abgeleitetes RPE seine strukturelle und funktionelle Unversehrtheit weitgehend beibehält. Dies ist vor allem für die Generierung patienten- und krankheitsspezifischer Zellbanken von großer Bedeutung. Es konnte somit gezeigt werden, dass dermale Fibroblasten als verlässliche Quelle zur Erzeugung von hiPSC-abgeleitetem RPE dienen, das in seinen strukturellen und funktionellen Eigenschaften humanem RPE gleicht. Weiterhin lieferten Immunzytofärbungen die Erkenntnis, dass das Transmembranprotein BEST1 bei den hier generierten mutanten hiPSC-abgeleiteten RPE-Reihen im Vergleich zu Kontrolllinien nicht weitgehend an der basolateralen Plasmamembran, sondern zum großen Teil auch diffus im Zytoplasma der Zellen zu finden war. Schließlich half das in dieser Arbeit erzeugte hiPSC-abgeleitete RPE in späteren Versuchen neue Erkenntnisse über die Rolle des Transmembranproteins BEST1 als volumenregulierter Chloridkanal und entscheidender Bestandteil volumenregulierter Anionenkanäle (volume regulated anion channels, VRACs) zu gewinnen und wird in Form kryokonservierter Zellbanken auch weiterhin für Versuche zur Verfügung stehen. Die wesentlichen Ergebnisse dieser Dissertation wurden bereits in “In-Depth Characterization of Retinal Pigment Epithelium (RPE) Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs)”, Brandl, Zimmermann et al. (2014) und “Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells”, Milenkovic, Brandl et al. (2015) veröffentlicht