Nutritional effects following phytogenic addition on the imprint of gut ecology physiological responses of broiler chickens

The aim of the present thesis was to evaluate the effects of the inclusion of phytobiotics in combination with different types of broiler chicken diets over their productive performances and the parameters of their intestinal health and function. For this purpose two different mixtures of phytobiotics, PFA1 (based on oregano, anise, and citrus essential oils) and PFA2 (a mixture of phytogenic components based on menthol, anethol, and eugenol), have been studied in relation /or not to the energy and protein levels of the respective diet or the type of cereal administrated (corn or wheat). A thorough analysis on important productive, biochemical, and molecular markers was conducted, such as broiler growth performance, feed consumption, feed conversion ratio, mortality rate, nutrient digestibility, total antioxidant capacity (TAC) in plasma and meat, as well as other biomarkers. Furthermore, the intestinal flora composition as well as the expression of genes related to the intestinal health and integrity was also determined. The abovementioned analytics were performed in the framework of five experimental studies, which also constitute separate chapters of this thesis.To be more specific, the first and forth study examined the effect of reduced dietary energy (ME) and protein (CP) levels along with administration of PFA1 on broiler growth performance, nutrient digestibility, meat and blood biochemical parameters and total antioxidant capacity (TAC), gut microbiota composition and gene expression of toll-like receptor(s) (TLR), tight junction (TJ) proteins and inflammatory cytokines expressed in secondary lymphoid organs. For each growth period three diet types (A, B and C) were formulated. Diet type A served as a positive control and was formulated according to Cobb recommendations for maximizing white meat yield. Diet types B and C were down regulated in terms of ME and CP by 3% and 6%, respectively. The ME:CP ratio was maintained constant. The duration of the experiment was 42d and 450 1-d old, male Cobb broilers were used. The statistical analysis of the results from the two aforementioned studies was prepared with the general linear model, using as factors the diet type, (A, B, and C) and the PFA1 supplementation (0 and 125 mg/kg).It was found that, while the decrease in energy and protein levels had as a result a significant deterioration of the feed conversion ratio (FCR), during the growth period (PD=0.021) and overall (PD=0.010), the PFA1 supplementation showed a trend to improve FCR during the starter (PPh1=0.090), grower (Ph1=0.057) period, and overall (PPh1=0.089). Adittionally, PFA inclusion reduced cholesterol (PPh0.002) and increased plasma TAC (PPh0.001). Moreover, PFA increased breast (PPh10.001) and thigh (PPh10.01) TAC. Furthermore, PFA1 supplementation resulted in higher levels of cecal mucosa-associated Bacteroides (PPh1=0.031), Clostridium cluster IV (PPh1=0.007) and Clostridium cluster XIVa (PPh1=0.039). Finally, lower TLR2 (PPh1=0.021) and higher zonula occludens 2 (ZO-2) (PPh1=0.031) relative gene expressions in ileal epithelium and lower TLR2 (PPh1<0.001) and higher ZO-2 (PPh1=0.009), claudin 5 (CLDN5) (PPh1=0.005) and occludin (OCLN) (PPh1=0.039) relative gene expressions in cecal epithelium, were resulted following PFA1 supplementation. In conclusion, a reduction in dietary ME and CP levels, adversely affected the FCR, whereas PFA1 supplementation tended to compensate these effects. Moreover, the addition of PFA1 beneficially modulated plasma cholesterol, plasma and meat TAC, elements of gut microbiota, Toll-like signaling molecules and gut tight junction genes.The supplementation of PFA2 was examined in the second, third and fifth study. More specifically, in the second and third study the effects of inclusion levels OF PFA2, on broiler growth performance, nutrient digestibility, biochemical biomarkers and total antioxidant capacity (TAC) of plasma and meat, as well as on the relative expression of selected cytokines, were studied in a 42-d experiment. A total of 225 one-day-old male Cobb broiler chickens were used in each study and the diets were based on maize-soybean meal (second study) and wheat-soybean meal (third study).The experimental data were analyzed with the ANOVA procedure and linear and quadratic effects of dietary PFA inclusion level were studied using polynomial contrasts. In the second study, FCR during finisher phase was improved quadratically (P=0.009) with increasing PFA level. Overall, increasing PFA level increased body weight gain (BWG) in a linear (P=0.018) and quadratic (P=0.016). Total tract apparent digestibility of dry matter increased linearly (P=0.001) and quadratically (P=0.023) with increasing PFA level. The apparent metabolizable energy corrected for nitrogen (AMEn) also increased linearly (P=0.005). Increasing PFA level resulted in a linear (P < 0.05) increase in blood plasma TAC. Overall, this study provided new evidence for the beneficial role of PFA2 as a natural growth and health promoter in broiler chickens when it is supplemented in diets based on maize-soybean meal. In the third study increasing PFA level increased (P=0.044) BWG at finisher period, decreased quadratically (P=0.035) overall feed intake, and quadratically improved (P=0.024) overall FCR. Moreover, increasing PFA level increased plasma total antioxidant capacity linearly (P=0.001) whereas linearly decreased (P=0.005) triglyceride concentration. Thigh meat cholesterol decreased linearly (P=0.016) with increasing PFA level. In conclusion, PFA inclusion at 100 mg/kg diet affected positively performance whereas a stronger improvement mainly in plasma total antioxidant capacity and triglyceride as well as in meat cholesterol was noted for the 150 mg/kg diet level. In the fifth study cereal type and the inclusion level of PFA2 were assessed for their effects on broiler gut microbiota composition, and expression of genes relevant for a functional gut barrier at ileal and cecal level.. The statistical analysis of the results from was prepared with the general linear model, using as factors the cereal type, (maize or wheat) and PFA2 inclusion level (i.e. 0, 100 and 150 mg/kg diet). The duration of the experiment was 42d and 450 1-d old, male Cobb broilers (from the second and third study) were used. Wheat fed broilers had increased levels of mucosa-associated Lactobacillus (PC=0.007) and digesta Bifidobacterium (PC<0.001) as well as lower levels of Clostridia subgroups I, IV and XIVa (PC≤0.05), compared to maize. Wheat had increased (PC≤0.05) ileal ZO-2 and decreased ileal and cecal TLR2 and IgA expression, compared to maize. On the other hand, PFA inclusion at 100 mg/kg increased the ileal mucosa expression of CLDN5 (PPh2=0.023) and MUC2 (P Ph2=0.001) genes, while at 150 mg/kg decreased cecal TLR2 (PPh2=0.022) gene expression compared to the un-supplemented controls. In summary, in the fifth study cereal type and PFA affected in combination and independently broiler gut microbiota composition as well as the expression of critical gut barrier genes including TLR2. In conclusion, this thesis provided new evidence that two different phytogenic feed additives (PFA1 and PFA2) beneficially affected broiler growth performance, antioxidant status and enhanced intestinal integrity and health.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή διερευνήθηκε σε βάθος η επίδραση της προσθήκης φυτοβιοτικών πρόσθετων υλών σε συνδυασμό με τον τύπο του σιτηρεσίου κρεοπαραγωγών ορνιθίων επί των παραγωγικών αποδόσεων και παραμέτρων της εντερικής υγείας και λειτουργίας. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικά τυποποιημένα φυτοβιοτικά ΦΣ1 (μίγμα φυτογενών συστατικών βασισμένο σε αιθέρια έλαια ρίγανης, γλυκάνισου και φλοιού εσπεριδοειδών) και ΦΣ2 (μίγμα φυτογενών συστατικών με κύρια συστατικά μενθόλη, ανηθόλη και ευγενόλη) τα οποία εξετάσθηκαν σε συνδυασμό ή μη με τα επίπεδα (συγκεντρώσεις) ενέργειας (ΜΕ) και πρωτεΐνης (ΟΠ) του σιτηρεσίου ή με το είδος του χορηγούμενου δημητριακού καρπού (αραβόσιτος ή σιτάρι). Πραγματοποιήθηκε ο αναλυτικός προσδιορισμός σειράς σημαντικών παραγωγικών, βιοχημικών και μοριακών δεικτών όπως της αύξησης του σωματικού βάρους, της κατανάλωσης της τροφής, του συντελεστή εκμετάλλευσης της τροφής, της θνησιμότητας, της πεπτικότητας των θρεπτικών συστατικών, της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας του αίματος και του κρέατος, καθώς και άλλων βιοχημικών δεικτών. Ακόμα προσδιορίστηκαν η σύνθεση της εντερικής μικροχλωρίδας και η έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την εντερική υγεία και ακεραιότητα. Οι παραπάνω αναλυτικοί προσδιορισμοί πραγματοποιήθηκαν στο πλαίσιο πέντε μελετών που αποτέλεσαν και ανεξάρτητα κεφάλαια της παρούσας διατριβής. Αναλυτικά στην πρώτη και την τέταρτη μελέτη εξετάσθηκε η επίδραση του ΦΣ1 σε συνδυασμό ή μη με την ελάττωση των επιπέδων ΜΕ και ΟΠ. Ο τύπος σιτηρεσίου Α χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας και καταρτίστηκε με βάση τις προδιαγραφές της Cobb για μέγιστη απόδοση των ορνιθίων κρεοπαραγωγής. Οι τύποι σιτηρεσίου Β και C, καταρτίστηκαν με ελάττωση των επίπεδων ΜΕ και ΟΠ κατά 3% και 6% αντίστοιχα και σε σύγκριση με τον τύπο σιτηρεσίου Α. Ο λόγος ΜΕ:ΟΠ διατηρήθηκε σταθερός σε όλους τους τύπους των σιτηρεσίων (Α, Β, C). Πραγματοποιήθηκε προσθήκη ή μη ΦΣ1 σε συγκέντρωση 125 mg/kg σιτηρεσίου, χρησιμοποιήθηκαν 450 αρσενικά ορνίθια κρεοπαραγωγής Cobb μιας ημέρας και το πείραμα ήταν διάρκειας 42 ημερών. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων που προέκυψαν στις 2 παραπάνω μελέτες έγινε με το γενικό γραμμικό μοντέλο, με παράγοντες τον τύπο (ΤΣ) του σιτηρεσίου (Α, Β και C) και την προσθήκη του ΦΣ1 (0 και 125 mg/kg). Διαπιστώθηκε ότι ενώ η ελάττωση των επιπέδων ΜΕ και ΟΠ είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική αύξηση του συντελεστή εκμετάλλευσης της τροφής (ΣΕΤ), κατά τη διάρκεια της φάσης ανάπτυξης (PΤΣ=0.021) και κατά τη συνολική διάρκεια του πειράματος (P=0.010), η προσθήκη ΦΣ1 παρουσίασε τάση βελτίωσης του ΣΕΤ κατά τη διάρκεια της εναρκτήριας φάσης (PΦΣ1=0.090), της φάσης ανάπτυξης (PΦΣ1=0.057) αλλά και καθόλη τη διάρκεια του πειράματος (P=0.089). Επίσης, η προσθήκη ΦΣ1 ελάττωσε (PΦΣ1=0.002) τη χοληστερόλη και αύξησε (PΦΣ1<0.001) την ολική αντιοξειδωτική ικανότητα στο πλάσμα του αίματος, ενώ ταυτόχρονα αύξησε την ολική αντιοξειδωτική ικανότητα στο στήθος (PΦΣ1<0.001) και στο μηρό (PΦΣ1=0.010) των ορνιθίων. Τέλος, η προσθήκη ΦΣ1 άσκησε ευεργετική επίδραση επί της συγκέντρωσης ωφέλιμων πληθυσμών βακτηρίων στο επιθήλιο του τυφλού εντέρου, όπως οι Bacteroides spp (PΦΣ1=0.031), Clostridium cluster IV (PΦΣ1=0.007) και Clostridium cluster XIVa (PΦΣ1=0.039), επί της έκφρασης των Toll-like υποδοχέων TLR2 στο επιθήλιο του ειλεού (PΦΣ1=0.021) και των τυφλών εντέρων (PΦΣ1<0.001), καθώς επίσης και των πρωτεϊνών στενού συνδέσμου zonoula οκλουδίνης 2 (ZO-2) (PΦΣ1=0.031) στο επιθήλιο του ειλεού και ZO-2 (PΦΣ1=0.009), κλαουδίνης 5 (CLDN5) (PΦΣ1=0.005) και οκλουδίνης (OCLN) (PΦΣ1=0.039) στο επιθήλιο των τυφλών εντέρων. Τα παραπάνω αποτελέσματα, παρέχουν ενδείξεις για τους τρόπους δράσης των φυτοβιοτικών στον οργανισμό των ορνιθίων και επιπρόσθετα υποστηρίζουν περαιτέρω την ευεργετική του επίδραση επί των των παραγωγικών αποδόσεων των ορνιθίων. Η προσθήκη ΦΣ2 εξετάσθηκε στο πλαίσιο τριών μελετών (π.χ. 2η, 3η και 5η). Πιο συγκεκριμένα στη δεύτερη μελέτη και την τρίτη μελέτη εξετάσθηκαν οι επιδράσεις των επιπέδων (συγκεντρώσεων) προσθήκης του ΦΣ2 με χορήγηση βασικού σιτηρεσίου αραβοσίτου-σογιάλευρου (2η μελέτη) και σιταριού-σογιάλευρου (3η μελέτη). Για την πραγματοποίηση καθεμίας εκ των δύο μελετών χρησιμοποιήθηκαν 225 αρσενικά ορνίθια κρεοπαραγωγής Cobb. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων που προέκυψαν έγινε με τη χρήση της ανάλυσης διασποράς (ANOVA) και η γραμμική και τετραγωνική επίδραση των επιπέδων προσθήκης του ΦΣ2 με τη μέθοδο πολυωνυμικών συγκρίσεων. Στη δεύτερη μελέτη παρατηρήθηκε τετραγωνική επίδραση επί του ΣΕΤ (P=0.009) στην τελική φάση πάχυνσης και συνολικά γραμμικό (P=0.018) και τετραγωνικό (P=0.016) μοτίβο αύξησης στο ρυθμό αύξησης του σωματικού βάρους (ΡΑΣΒ) των ορνιθίων με την αύξηση των επιπέδων προσθήκης του ΦΣ2. Επιπρόσθετα, με την αύξηση των επιπέδων προσθήκης του ΦΣ2, η ολική φαινομένη πεπτικότητα της ξηράς ουσίας παρουσίασε γραμμικό (P=0.001) και τετραγωνικό (P=0.023) μοτίβο αύξησης ενώ γραμμικό μοτίβο (P=0.005) αύξησης παρατηρήθηκε και για τον συντελεστή φαινομένης μεταβολιστέας ενέργειας διορθωμένο κατά το άζωτο (AMEΝ). Τέλος, αυξανομένων των επιπέδων προσθήκης του ΦΣ2 η ολική αντιοξειδωτική ικανότητα στο πλάσμα του αίματος παρουσίασε γραμμικό μοτίβο αύξησης (P=0.031). Συνολικά στη δεύτερη μελέτη, διαπιστώθηκε ο ωφέλιμος ρόλος του ΦΣ2 ως φυσικού αυξητικού παράγοντα και παράγοντα υγείας σε ορνίθια κρεοπαραγωγής στα οποία χορηγήθηκε σιτηρέσιο βασισμένο στον αραβόσιτο και το σογιάλευρο. Στην τρίτη μελέτη, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, η αύξηση των επιπέδων προσθήκης ΦΣ2 είχε ως αποτέλεσμα, την εμφάνιση γραμμικού μοτίβου αύξησης (P = 0.044) για το ΡΑΣΒ στην τελική φάση πάχυνσης, τετραγωνικού μοτίβου μείωσης (P = 0.035) για την κατανάλωσης της τροφής (ΚΤ) και τετραγωνικού μοτίβου ελάττωσης (P = 0.024) για το ΣΕΤ συνολικά καθόλη τη διάρκεια του πειράματος. Επιπρόσθετα, η αύξηση των επιπέδων προσθήκης του ΦΣ2, προκάλεσε την εμφάνιση γραμμικού μοτίβου αύξησης (P = 0.001) της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας καθώς επίσης και γραμμικού μοτίβου μείωσης (P = 0.005) της συγκέντρωσης των τριγλυκεριδίων στο πλάσμα του αίματος των ορνιθίων και γραμμικού μοτίβου μείωσης (P=0.016) της συγκέντρωσης της χοληστερόλης στο κρέας (μηρό). Συμπερασματικά, η προσθήκη ΦΣ2 σε συγκέντρωση 100 mg / kg σιτηρεσίου άσκησε ευεργετική επίδραση επί της παραγωγικής απόδοσης των ορνιθίων ενώ άσκησε ισχυρότερη ευεργετική επίδραση στη συγκέντρωση των 150 mg / kg επί της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας και της συγκέντρωσης τριγλυκεριδίων στο πλάσμα του αίματος καθώς επίσης και της συγκέντρωσης χοληστερόλης στο κρέας των ορνιθίων.Tέλος, στην πέμπτη μελέτη διερευνήθηκαν οι επιδράσεις των επιπέδων προσθήκης ΦΣ2 ως προς το είδος του χορηγούμενου δημητριακού καρπού που ήταν αραβόσιτος (Α) ή σιτάρι (Σ) επί των εξεταζόμενων παραμέτρων. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν τα 450 ορνίθια κρεοπαραγωγής της δεύτερης και τρίτης μελέτης και η στατιστική ανάλυση έγινε με το γενικό γραμμικό μοντέλο -γενική παραγοντική ανάλυση ANOVA, με παράγοντες το είδος του δημητριακού καρπού (ΔΚ) και των επιπέδων προσθήκης του ΦΣ2 (0, 100 και 150 mg/kg σιτηρεσίου). Σημαντικές αλληλεπιδράσεις (P≤0.05) μεταξύ του είδους του χρησιμοποιούμενου δημητριακού καρπού και των επιπέδων προσθήκης ΦΣ2 παρουσιάστηκαν για τους πληθυσμούς των βακτηρίων Bacteroides και Clostridium cluster XIVa στο εντερικό περιεχόμενο των τυφλών εντέρων. Η χρησιμοποίηση σιταριού στα σιτηρέσια των ορνιθίων προκάλεσε αύξηση των επιπέδων των πληθυσμών των βακτηρίων Lactobacillus (PΔΚ=0.007) στο επιθήλιο και των Bifidobacterium (PΔΚ